偏最小二乘回归原理、分析步骤及程序

介绍偏最小二乘回归处理多重共线性问题的原理、分析步骤,并给出了相应的SAS程序。     

mOX40-Ig的表达及其生物学活性的初步研究

目的:构建pcDNA3.1-mOX40-Ig真核表达载体,转染CHO细胞进行稳定表达,获得有生物学活性的mOX40-Ig融合蛋白.方法:RT-PCR法扩增获得hIgG1Fc段基因,构建pcDNA3.1-hIgG1Fc重组质粒并经测序证实.从本室保存的pIRES2-EGFP-mOX40重组质粒中PCR扩增mOX40胞外段,将其插入pcDNA3.1-hIgG1Fc重组质粒中构建pcDNA3.1-mOX40-Ig真核表达载体.脂质体法转染CHO细胞获得稳定表达,用RT-PCR与ELISA法检测其表达,蛋白A亲和纯化后,SDS-PAGE进行鉴定.3H-TdR掺入法研究OX40信号对B细胞的体外促增殖作用.结果:测序证实hIgG1Fc段、mOX40胞外段及mOX40-Ig基因序列正确,RT-PCR与ELISA证实mOX40-Ig的表达,SDS-PAGE证实其为mOX40-Ig融合蛋白,3H-TdR掺入法显示mOX40-Ig在体外能有效地促进B细胞增殖.结论:成功地构建pcDNA3.1-mOX40-Ig真核表达载体,并获得有生物学活性的mOX40-Ig融合蛋白的稳定表达,为进一步开展OX40相关领域的横向应用研究奠定了基础.     

OX40/OX40L共刺激途径与移植免疫

OX40/OX40L途径是T细胞活化的共刺激信号之一,尤其对维持T细胞初次活化后的进一步增殖、存活、分化为效应细胞及记忆性T细胞是必需的共刺激信号。阻断这一信号途径可能在诱导移植耐受和治疗移植排斥中具有重要价值。本文就近几年来有关Ox4/OX40L与器官移植及骨髓移植方面的研究进展作一综述。     

IL-32原核表达载体的构建及表达

目的 构建人IL-32原核表达载体,并进行初步诱导表达.方法 PCR扩增IL-32基因并将其与原核表达质粒pET32a(+)连接,重组pET32a- IL-32经PCR、酶切及测序鉴定后转入表达菌株BL21(DE3)进行融合蛋白的少量诱导表达,SDS-PAGE和Western Blotting检测目的蛋白表达及水平.结果 含有重组质粒的表达菌株经IPTG诱导后获得高效表达,融合蛋白主要存在于包涵体中,重组蛋白表达水平占总蛋白的27.5%;Western Blotting分析表明该蛋白可与特异性抗体发生结合.结论 构建了人IL-32基因的原核表达载体,获得IL-32融合蛋白.     

mOX40-Fc的真核表达及其对混合淋巴细胞反应的影响

构建重组pcDNA3.1-mOX40-Fc真核表达载体,在CHO细胞中表达,并初步研究融合蛋白mOX40-Fc对MLR中细胞增殖的影响。克隆编码hIgG1Fc基因片段,与编码小鼠OX40胞外段的基因融合,构建mOX40-Fc融合基因及其分泌型真核表达载体pcDNA3.1-mOX40-Fc;转染CHO细胞构建融合蛋白的稳定真核表达细胞株,用RT-PCR及夹心ELISA检测其表达,纯化后经SDS-PAGE及Western blot法对其进行鉴定,混合淋巴细胞反应(MLR)测定其生物学活性。结果:核苷酸序列测定显示构建的mOX40胞外段和hIgG1Fc段基因序列与GenBank序列一致、阅读框完整;RT-PCR、ELISA和Western blot检测表明转染细胞有分泌型重组蛋白的表达;功能实验提示mOX40-Fc能抑制MLR中的细胞增殖。成功构建mOX40-Fc真核表达载体并获得高效表达,该重组蛋白可在体外通过抑制OX40/OX40L共刺激通路抑制淋巴细胞增殖。     

小鼠OX40原核表达载体的构建及表达

目的构建小鼠OX40胞外段基因的原核表达载体并进行诱导表达。方法PCR扩增OX40胞外段基因并将其插入原核表达质粒pET32a（＋），重组pET32a—OX40经测序鉴定后转入表达菌株BL21（DE3）进行融合蛋白的小量诱导表达。结果出现新增蛋白条带，融合蛋白主要存在于包涵体中；Western Blotting分析表明该融合蛋白可与相应抗体发生特异性结合。结论构建了小鼠OX40基因的原核表达载体，获得OX40胞外段融合蛋白。     

分泌型小鼠IL-1β表达载体促进Hepa1-6肝癌细胞的增殖和迁移

目的:构建小鼠经典途径分泌型IL-1β真核表达载体,转染Hepa1-6细胞后,检测胞质及上清中IL-1β分泌表达水平,并考察其对肝癌细胞体外增殖活性、迁移能力的影响。方法:利用特异性上下游引物将小鼠AFP信号肽序列和小鼠IL-1β成熟蛋白编码基因进行拼接后,再与pLIVETM载体进行连接,DNA测序鉴定阳性克隆;jetPEI法将重组载体、pLIVETM空载体、pLIVE-lacZ转染小鼠肝癌细胞株Hepa1-6后,经β-gal染色监测转染效率;各转染组经LPS及monesin处理后双抗体夹心ELISA法分析细胞培养上清及细胞裂解液中IL-1β的表达水平;通过MTT方法分析经典途径分泌型IL-1β对细胞体外增殖活性的影响。结果:成功构建出了小鼠分泌型IL-1β真核重组表达载体pLIVE-smIL-1β;β-gal染色后,显示外源基因在3 d左右时转染效率最高;双抗体夹心ELISA法表明转染后与Hepa1-6/mock组细胞相比,Hepa1-6/smIL-1β组细胞胞质和上清中IL-1β的表达明显增高;MTT及细胞迁移实验分析证实,转染Hepa1-6/smIL-1β组细胞体外增殖速度明显加快。结论:该表达载体可以通过经典途径分泌促炎性因子IL-1β且高效表达成熟肽IL-1β,并能够显著促进肿瘤细胞的体外增殖和迁移能力。