肝移植急性排异患者外周血Th17及调节性T细胞的特征及意义

目的 探讨肝移植术后急性排异患者外周血中Th17细胞、CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(Treg)的变化特征及临床意义.方法 2011年1-9月解放军302医院肝移植研究中心收治的肝移植术后患者25例,根据移植组织穿刺活检病理结果分为急性排异组(排异组,12例)和非排斥稳定组(稳定组,13例),另选取13名健康体检者作为对照.采用流式细胞分析法检测外周血中Th17、Treg细胞占CD4+T细胞的比例,观察Th17/Treg比值变化及其与肝脏损伤的关系.结果移植术后排异组外周血中Th17占CD4+T细胞的比例(3.50％±0.86％)明显高于稳定组(2.10％±0.52％)和对照组(1.79％±0.42％,P＜0.01),稳定组和对照组比较无统计学差异(P＞0.05).排异组和稳定组患者外周血中Treg占CD4+T细胞的比例(分别为0.90％±0.25％、1.51％±0.23％)明显低于对照组(2.57％±0.79％,P＜0.01),且排异组明显低于稳定组(P＜0.05).排异组Th17/Treg比值(4.20±1.69)明显高于稳定组(1.43±0.47)及对照组(0.75±0.28,P＜0.01),且稳定组明显高于对照组(P＜0.01).Th17/Treg比值与丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、谷氨酸转氨酶(GGT)水平呈正相关(分别为r=0.5023,P=0.0105; r=0.4561,P=0.0219;r=0.4393,P=0.0280; r=0.5516,P=0.0043).结论 肝移植术后急性排异反应患者外周血中存在Th17/Treg失衡,且与肝脏损伤有一定关系.Th17/Treg失衡可能参与了肝移植术后急性排异反应的发生发展过程.     

慢性病毒感染性疾病的治疗性树突状细胞疫苗研究进展

树突状细胞（dendritic cells，DCs）是免疫系统的专职抗原递呈细胞（antigen presenting cell，APC），是T细胞特异免疫应答的直接启动者和调控者，是连接天然免疫与特异性免疫的桥梁。DCs在外周血与组织中摄取和处理抗原之后，迁移到引流淋巴结，在淋巴结T细胞富集区将抗原递呈给静止淋巴细胞。未成熟的DCs能摄取和处理抗原，在完全成熟后，DCs表面表达高水平的MHC-抗原肽复合物及共刺激分子，此时才能有效激活T细胞反应。     

清解活血法治疗病毒性肝炎240例临床观察

本文总结甲型肝炎患者肝功能持续异常者240例,采用清解活血法辨证治疗,临床治愈232例,占96.7%;好转7例,占2.9%;无效1例,占0.4%:临床治愈病例,半年后随访结果,均达到基本治愈标准。     

基于CRISPR/Cas9技术构建多重sgRNA实现在人原代T细胞中敲除ADRB2基因

目的:利用CRISPR/Cas9技术,通过多重sgRNA策略,实现在人原代T细胞中ADRB2基因的快速、高效敲除。方法:针对ADRB2基因5'端组成性外显子设计6条sgRNA,通过与pGL3-U6-sgRNA-PGK-Puro载体连接,构建6个单一sgRNA表达载体,分别与Cas9表达载体瞬时转染HEK-293T细胞;通过T7EN I酶切检测其介导的切割效率,筛选出4条高活性的配对sgRNA。继而将4条sgRNA有序串联克隆至pGL3-U6-sgRNA-ccdB-EF1α-Puro载体,构建成靶向ADRB2基因的多重sgRNA表达载体。瞬时转染HEK-293T细胞后,经T7EN I酶切和TA克隆测序明确其对ADRB2基因的修饰效率及方式。通过电穿孔技术将多重sgRNA质粒与Cas9质粒导入人原代T细胞。运用流式细胞术(FCM)检测该方法对靶蛋白β2肾上腺素能受体(β2 adrenergic receptor,β2-AR)的敲除效率。结果:T7EN I酶切和TA克隆测序分析的结果均表明,与单一sgRNA相比,多重sgRNA策略可获得更丰富的突变类型和更高的基因编辑效率。突变模式除了碱基的缺失、插入,还有大片段DNA缺失、倒位。随机送检的10个TA克隆全部发生了基因修饰,突变效率高达100%,且均出现了提前终止密码子。FCM检测发现,对照组中β2-AR阳性T细胞比例为43. 09%,但转染多重sgRNA/Cas9后β2-AR的阳性表达率下降至25. 61%。结论:本研究初步建立了在人原代T细胞中敲除β2-AR的技术方法,且该方法简便、可操作性强。本研究为进一步深入探索β2-AR在人T细胞抗肿瘤免疫中的作用奠定了技术基础。     

从随机9肽库中筛选HCV抗原表位

目的 :用患者血清中抗HCV抗体从随机 9肽库中筛选HCV抗原表位。方法 :将病人血清用硫酸铵粗提后 ,用ProteinA亲和层析柱纯化和制备抗HCV多克隆抗体 ;以此为筛选配基 ,对噬菌体表面展示的随机 9肽库进行亲和筛选。结果 :三轮筛选的投入产出比逐轮升高至 5 0× 10 - 3 、假阳性率逐轮降低至 0 2 % ,提示具有良好的富集效果。从第三轮挑选出的 15个克隆进行结合试验 ,发现 7个克隆只与HCV抗体有较强的结合力而不与正常人血清反应 ;测序表明 6个克隆的外源肽含有核心序列SPVAXVLXT。用阳性噬菌体克隆检测 2 0例病人血清 ,有程度不等的阳性反应。结论 :用多克隆抗体从噬菌体随机肽库中筛选得到了有一定功能的模拟表位。     

抗人P185erbB2 scFv-Fc-IL-2增强LAK样和ADCC杀伤作用及机制的实验研究

目的 将抗人P185erbB2 scFv-Fc-IL-2融合蛋白(HFI)分别作用于表达高、中、低3个水平erbB2受体的SKOV3、MCF-7、SGC-7901三株肿瘤细胞和健康人外周血单个核细胞(PBMC),探讨HFI调变肿瘤细胞表面分子,激活免疫效应细胞的机制;模拟体内肿瘤组织,将HFI-PBMC-肿瘤细胞混合培养,探讨HFI对分别表达高、中、低3个水平erbB2肿瘤细胞的淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)样和抗体依赖性细胞介导的细胞毒(ADCC)作用,为临床应用提供实验依据.方法 MTF法检测细胞增殖、杀伤活性;流式细胞术检测细胞表面分子的表达变化;应用非核素细胞毒试剂盒观察HFI介导ADCC杀伤作用.结果 HFI处理后SKOV3细胞表面杀伤相关分子细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、Fas表达水平分别由24.85%、0.53%增高到85.36%、59.19%;SKOV3、MCF-7、SGC-7901三株肿瘤细胞erbB2表达水平分别由98.48%、42.60%、36.66%下降到94.01%、30.95%、12.36%.HFI刺激后人PBMC的增殖活性显著增强,呈时间依赖效应,CD3+ CD8+ T细胞和CD3- CD16+ CD56+NK细胞分别由24.37%、6.90%提高到38.80%、13.45%,CD25、淋巴细胞功能抗原-1(LFA-1)、FasL表达水平分别由3.99%、86.52%、5.02%提高到12.96%、99.06%、16.19%.HFI活化的人PBMC对不同erbB2表达水平肿瘤细胞的LAK样杀伤活性,在各效靶比均比对照组明显提高.HFI能够介导和增强人PBMC对表达erbB2肿瘤细胞的ADCC杀伤作用.结论 HFI上调SKOV3细胞表面杀伤相关分子ICAM-1、Fas表达,下调肿瘤细胞表面erbB2表达.HFI对人PBMC具有明显的激活增殖作用,活化的人PBMC对表达不同水平erbB2肿瘤细胞的LAK样杀伤作用均显著增强.HFI能够介导和增强人PBMC对肿瘤细胞的ADCC杀伤作用,且杀伤活性的高低与肿瘤细胞表面erbB2表达水平的高低呈平行关系.     

自体细胞因子诱导杀伤细胞治疗HBV感染肝硬变患者的临床疗效分析

目的观察自体细胞因子诱导杀伤细胞(CIK细胞)治疗HBV DNA阳性肝硬化患者的近期疗效。方法33例HBV DNA阳性肝硬化患者给予CIK细胞治疗,在体外培养前后以及回输体内后检测CD3 、CD3 CD4 、CD3 CD8 、CD3 CD56 、CD25 细胞以及mDC和pDC。比较治疗前后病毒学指标及肝脏功能的变化。结果培养结束以及回输体内后,CD3 细胞、CD3 CD8 细胞、CD3 CD56 细胞较培养前显著升高,mDC和pDC在回输后也明显增高。12例患者HBV DNA阴转,4例患者拷贝数下降大于2个log。在14例HBeAg阳性患者中有10例阴转,2例出现HBeAb转换。肝脏功能较治疗前有所好转。所有患者均能耐受治疗。结论CIK细胞可明显提高免疫效应细胞数量,具有一定的抗病毒效应作用,毒副作用低。     

c-erbB-2基因工程抗体的构建及在哺乳动物细胞中的表达

原癌基因ＨＥＲ－２／ｎｅｕ／ｅｒｂＢ－２编码的１８５－ｋＤａ跨膜磷酸糖蛋白为受体酪氨酸激酶家族中的成员。已报道ｃ－ｅｒｂＢ－２在多种腺癌中过表达，其中包括１５％～４０％的早期及转移性乳腺癌和卵巢癌［１］。亦有人报道，约７３％的转移性乳腺癌和卵巢癌过表达 ＨＥＲ－２／ｎｅｕ［２］，表明其为乳腺癌靶向性免疫治疗的理想靶分子。我们采用基因工程技术，构建了ｃ－ｅｒｂＢ－２ ＳｃＦｖ基因，并获得了其在ＣＯＳ７细胞中的表达。ｌ 材料和方法１．ｌ材料ＣＯＳ７细胞为本室保存。载体ｐｃＤＮＡ３．ｌ购自Ｉｎ－ｖｉｔｒ…     

间充质干细胞免疫调节特性与临床应用的研究进展

间克质于细胞(mesenchymal stem cell,MSC)是可以从骨髓、脂肪、脐带、骨膜等组织分离而来的一种干细胞,具有黏附培养基生长的特性和复杂的免疫表型,可以向3个胚层细胞分化.MSC在组织修复和再生方面有良好的治疗效果.MSC回输体内可以定位到受损的组织,并且通过上调抗炎症细胞因子和下调促炎症细胞因子,调节受损部位的炎症反应.此外,MSC有显著的免疫调节特性,可以抑制T细胞、NK细胞等细胞的功能,调节树突状细胞的活性而诱导免疫耐受,在临床上具有广泛的应用前景.     

RACE策略克隆抗人CD16单克隆抗体轻链可变区基因

鼠源性单克隆抗体(mAb)应用于人体治疗首先需对其进行基因工程化改造。目前,常用的克隆mAb可变区基因的方法,是利用抗体可变区内骨架区(FR)序列的保守性,设计一组通用引物,采用RT-PCR法扩增可变区基因[1,2]。但由于引物的简并性,克隆过程中将不可避免地改变抗体可变区两侧(FR1、FR4)的氨基酸序列,这些改变可能导致基因工程抗体亲和力降低[3]。我们对传统方法进行了改进,采用5’-RACE(rapid amplification of cDNA end,RACE)克隆的策略,获得了抗人CD16 mAb轻链可变区(VL)基因的真实序列。