一株鼠抗人4-1BBL功能性单克隆抗体的研制及其生物学特性的研究

目的：鼠抗人4—1BBL功能性单克隆抗体的研制及其生物学特性的鉴定。方法：以高表达人4—1BBL分子的基因转染细胞L929／4—1BBL为免疫原，常规免疫BALB／c小鼠，采用B淋巴瘤杂交瘤技术进行细胞融合，经流式细胞术分析和多次克隆化培养，筛选特异性杂交瘤细胞株；采用Ig亚型快速定性试纸法、染色体核型分析、竞争结合抑制试验、间接免疫荧光法对单抗的生物学特性进行鉴定，并采用体外细胞计数和ELISA检测分析单抗对单核细胞的作用。结果：获得1株持续、稳定分泌鼠抗人4-1BBL单抗的杂交瘤细胞株，命名为3E7。该单抗能识别人白血病细胞株和单核细胞表面的4-1BBL分子。对单抗生物学功能的研究结果表明，该单抗能有效地促进外周血单核细胞体外生长，并促进IL-6和TNF-α的分泌。结论：成功地获得了一株鼠抗人4-1BBL功能性单克隆抗体3E7，该单抗能特异地识别人4-1BBL分子，并有效地通过激发4-1BBL逆向信号通路促进单核细胞的体外生长及细胞因子的分泌。     

鼠抗人CD28功能性单克隆抗体的研制及其生物学特性的鉴定

以天然表达CD28分子的人多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)细胞:XG-1为免疫原,常规免疫BALB/c小鼠,采用B淋巴细胞杂交瘤技术进行细胞融合,CD28转基因细胞株(T-28)及XG-1为抗体筛选阳性细胞株,经免疫荧光标记分析反复筛选和多次的克隆化培养,最终获得1株持续、稳定分泌鼠抗人CD28单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为10F3。对这株单抗生物学功能的研究结果表明,这株抗体能特异性地识别人CD28分子和介导有效的共刺激信号,激发T细胞的活化和增殖。     

PD-L1和PD-L2在树突状细胞上的表达及其生物学意义

探讨小鼠髓系DC (CD8α )中PD L1和PD L2的表达及其在T淋巴细胞活化中的作用。采用mCD4 0L CHO和TNF α分别刺激凋亡肿瘤细胞负载DC 4 8h ;免疫荧光标记检测DC表型 ;RT PCR和realtime PCR检测PD L1和PD L2mRNA转录水平 ;ELISA测定IL 2的分泌水平 ;3 H TdR掺入试验和51Cr释放试验测定DC体外激发T细胞的增殖和细胞毒杀伤率。结果显示 :PD L1和PD L2随着DC的成熟呈上调表达 ,CD4 0配基化DC的PD L1和PD L2均为中度表达 ,TNF α激发的DC为高度表达 ,二者呈现差异性表达 (P <0 0 5 ) ;CD4 0配基化髓系DC分泌IL 2的量明显高于TNF α组 (P <0 0 5 ) ,体外刺激T增殖和激活CTL能力在CD4 0配基化DC组最高 (P <0 0 5 )。提示CD4 0配基化的小鼠髓系DC呈现PD L1和PD L2的中度表达 ,IL 2大量分泌 ,这些均有助于激发有效的特异性免疫应答     

抗人CD40人-鼠嵌合抗体的构建及其表达

目的:通过基因工程抗体改造技术构建并表达抗人CD40人-鼠嵌合抗体。方法:从分泌鼠抗人CD40单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株(5C11)中提取总RNA,用一对特异性引物通过RT-PCR扩增mAbVH和VL的DNA编码区基因。根据序列分析的结果,设计引物扩增VH和VL基因相应的信号肽序列。利用基因重组技术,将mAb5C11的VH、VL基因及其相应信号肽序列与人IgG1的CH基因、Cκ链基因进行拼接,构建人-鼠嵌合抗体基因的表达质粒pIRES/h5C11。用脂质体法将其导入293T细胞株中进行瞬时表达。利用流式细胞术对表达产物进行鉴定。结果:NCBI基因数据库Blast的结果显示,克隆的基因序列符合小鼠VH、VL基因及其信号肽序列的特征。表达质粒pIRES/h5C11的构建正确,并在293T细胞株中获得瞬时表达。表达的抗人CD40的人-鼠嵌合抗体和mAb5C11具有相同的抗原结合位点。结论:成功地克隆了鼠抗人CD40mAbV区编码基因,并实现了可溶性抗人CD40的人-鼠嵌合抗体在293T细胞中的瞬时表达。     

耐药质粒介导宿主菌抵抗非特异性免疫应答的研究

研究伤寒杆菌的耐药质粒pRST98是否能增强宿主菌的毒力 ,抵抗机体非特异性免疫应答———血清杀菌和巨噬细胞吞噬作用。 3株具有同源染色体的伤寒杆菌 (1)携带pRST98的野生型伤寒杆菌—STpRST98;(2 )经SDS人工消除pRST98的突变体菌株—ST (R ) ;(3)将pRST98重新导入突变体的接合子—pRST98/ST (R )菌株 ,用体外试验比较它们在人、兔及豚鼠 3种不同浓度、不同成分血清中的存活率 ,研究pRST98与血清杀菌试验中细菌抵抗力的关系。将荧光染料标记以上 3株细菌 ,用流式细胞术 (FCM )和标准系列稀释法检测它们被BALB/c小鼠腹腔巨噬细胞MΦJ774A 1吞噬和吞噬后在细胞内的存活情况。实验结果表明 ,携带pRST98的伤寒杆菌在血清中的抵抗力显著大于无此质粒的菌株 (P <0 0 5 ) ,被巨噬细胞吞噬的标记ST (R )菌量显著多于STpRST98和pRST98/ST (R ) ,但pRST98宿主菌在巨噬细胞内的活菌数却明显多于无此质粒的菌株 (P <0 0 5 )。说明pRST98不但能编码对药物的抗性 ,还能提高其宿主菌抵抗机体非特异性免疫应答的能力     

抗人CD154人-鼠嵌合抗体Fab段的构建和表达

目的:通过基因工程技术构建和表达抗人CD154人-鼠嵌合抗体Fab段。方法:从分泌鼠抗人CD154单克隆抗体(mAb)的杂交瘤细胞株4F1中提取总RNA,分别采用特异性引物扩增mAb VH和VL的DNA编码区基因。同时,从人脾脏细胞中克隆出免疫球蛋白恒定区基因。利用基因重组技术构建嵌合Fab共表达载体pTXB1-Fab,利用大肠杆菌表达简单,高效,成本低廉的特点,对重组Fab进行原核表达。利用SDS-PAGE电泳、Western blot、流式细胞术对表达产物进行鉴定。结果:NCBI数据库BLAST显示,克隆的基因序列符合小鼠Ig可变区特征。表达质粒pTXB1-Fab构建正确,在大肠杆菌中实现可溶性表达。表达的人-鼠嵌合抗体与亲本抗体具有相同的识别位点。结论:成功地克隆获得阻断型抗人CD154 mAb(4F1)的轻链、重链可变区基因,成功构建pTXB1-Fab共表达载体,在大肠杆菌中实现可溶性表达,为人源化抗体的制备奠定了技术基础。     

鼠抗人Syndecan-1分子功能性单克隆抗体的制备及其生物学特性

制备鼠抗人Syndecan-1(CD138)分子的功能性单克隆抗体,研究其对高表达CD138分子细胞的生物学效应。以人多发性骨髓瘤(MM)细胞株8226作为免疫原,8226和B淋巴瘤细胞株Daudi作为检测细胞株,利用B淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体。以快速定性试纸分析法鉴定单抗所属的IgG亚类,采用间接免疫荧光标记法及竞争抑制实验分析单抗的亲和力和特异性,以高表达Syndecan-1的人多发性骨髓瘤细胞株XG-1为靶细胞,分析单抗对其生长的影响。结果:成功地获得1株鼠抗人Syndecan-1分子的功能性单克隆抗体杂交瘤细胞株(克隆4B3),经体外长期传代培养,液氮冻存半年以上反复复苏良好,分泌特异性抗体性能稳定。4B3分泌的单克隆抗体识别位点与单抗BB4识别位点相同或相近,重链为IgG1亚类,轻链为κ型,纯化后腹水中单克隆抗体蛋白的得率为2.9 mg/ml,加入4B3单克隆抗体后的XG-1细胞体外生长受到抑制,并可用于神经胶质瘤细胞的免疫组织化学检测。由此表明,4B3为功能性抗人Syndecan-1单克隆抗体,具有一定的基础研究和临床应用前景,这对进一步研究Syndecan-1分子的生物学特性也具有重要的价值。     

重组人sCD40L-IZ基因的克隆、原核表达及重组三聚体蛋白的鉴定

目的:克隆并表达有生物学活性的CD40配体(CD40ligand,CD40L)重组蛋白。方法:应用PCR技术克隆CD40L胞外功能区(E107-L261)基因,并在其N端融合异亮氨酸拉链(isoleucinezipper,IZ)促使其形成三聚体活性形式,同时为了后期纯化的需要,在IZ的N端融合6个His,将所融合得到的sCD40L-IZ克隆进入pET30a表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)表达体系进行诱导表达。结果:重组蛋白sCD40L-IZ以包涵体形式在大肠杆菌(BL21)中得到较高水平的表达。通过蛋白的变性、复性和HiTrapTM亲和层析获得了纯度达95%以上的sCD40L-IZ重组蛋白。经凝胶过滤层析和非还原SDS-PAGE分析验证了其确有三聚体形式。激光共聚焦实验结果表明,重组蛋白sCD40L-IZ可与骨髓瘤细胞株XG2表面CD40分子结合,并促使其在膜表面发生聚集。结论:人sCD40L-IZ重组蛋白在大肠杆菌体系得以成功表达,并以三聚体活性形式发挥功能,为今后进一步研究其与凋亡、疾病发病机制的关系及其在临床治疗中的应用奠定了基础。     

B7-1 mAb对B系淋巴瘤Raji细胞的生长抑制和凋亡诱导作用

为了研究B7 1分子功能性mAb (6H2 )对表达B7 1分子的B系淋巴瘤Raji细胞的生物效应。分别运用免疫荧光标记和流式细胞仪技术 (FACS )、台盼蓝拒染试验、MTT试验和RT PCR半定量分析 ,分析 6H2对Raji细胞的生长抑制和凋亡诱导作用。结果显示 ,6H2能抑制天然表达B7 1分子的人B系淋巴瘤Raji细胞的生长 ,产生细胞周期G2 /M的阻滞 ,上调细胞表面CD18和CD95 (Fas )的表达 ,且能使Raji细胞中Bax的相对转录表达显著增加 ,从而诱导Raji细胞的凋亡。 6H2为功能性抗人B7 1分子特异性mAb ,具有抑制Raji细胞生长和凋亡诱导作用 ,在B系淋巴瘤研究和生物治疗中具有应用价值。     

4株鼠抗人B7-1分子单抗的制备及其生物学活性的鉴定

目的：制备鼠抗人B7—1分子(mAb)单抗及研究其生物学活性。方法：以人多发性骨髓瘤细胞转人B7-1基因细胞株XG7-B7为免疫原，采用B淋巴细胞杂交瘤技术制备鼠抗人B7—1分子单抗；以Western blot及间接免疫荧光标记法鉴定其特异性和亲和力；采用^3H—TdR掺入实验和Annexin-Ⅴ染色分析测定该单抗的生物学功能。结果：获得了4株持续分泌抗人B7—1分子的特异性单抗的杂交瘤细胞株，分别命名为1F11、3H8、6H2和7B10，其分泌的单抗类别分属于小鼠IgG1和IgM；4株单抗均具有良好的特异性和亲和力；1F11、3H8和6H2能部分组断B7—1分子基因转导细胞介导的共刺激信号，从而抑制T细胞的增殖效应(抑制率21％—52％)；且能诱导天然表达B7—1分子的人B系淋巴瘤细胞Raji的凋亡。结论：成功研制4株功能性抗人B7—1分子抗体，这些抗体在抗异体组织器官移植排斥反应及在B系淋巴瘤的治疗中具有潜在的应用价值。