同种异体骨髓间充质干细胞移植治疗创伤性脑损伤的遗传安全性评估

目的初步探讨同种异体骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植治疗创伤性脑损伤(TBI)的遗传安全性。方法 (1)体内实验:分离提取并传代培养雄性SD大鼠的BMSCs。将微量药物注射套管植入并固定于12只雌性SD大鼠左侧侧脑室3 d后, 用气压精密打击器对大鼠右侧大脑皮层进行打击以制备成中度TBI模型。分别于造模后4 h、3 d、6 d、9 d、12 d时经套管对TBI大鼠进行单次/多次BMSCs输注(2.5×105个/次, 总体积10 μL), 并分别取造模后48 h、72 h、10 d和14 d时TBI大鼠(每时间点3只)的脑组织制备成石蜡标本, 应用免疫荧光染色检测小胶质细胞激活情况, 应用RNAscope?技术检测星形胶质细胞、神经元、小胶质细胞与移植的BMSCs的共定位情况, 以观察同种异体BMSCs移植至TBI宿主体内后是否与宿主脑内细胞发生整合现象。(2)体外实验:先将冻存复苏的小胶质细胞株BV2用绿色荧光蛋白(GFP)阳性慢病毒颗粒转染, 再将pHrodo RED探针预标记的BMSCs与经脂多糖预处理的BV2细胞分别按一定比例(BV2∶BMSCs=1∶1、1∶2、2∶1)进行共...     

慢病毒介导增强型绿色荧光蛋白基因修饰人骨髓基质细胞***☆

背景：原代细胞的转染效率低下一直是制约其发展的主要因素之一,慢病毒转染以其独特的优势成为各种干细胞基因修饰良好的转染方法。 目的：验证慢病毒载体介导增强型绿色荧光蛋白基因修饰人骨髓基质细胞的可行性。 方法：将携带增强型绿色荧光蛋白基因的慢病毒在含血清或无血清条件下按不同的MOI值分别转染人骨髓基质细胞,长期观察荧光蛋白表达情况。将经修饰的细胞通过立体定向移植入大鼠纹状体内,观察移植细胞的存活及目的基因的表达情况。 结果与结论：基因转染48 h后,可见人骨髓基质细胞成功表达绿色荧光蛋白,无血清条件下的转染效率高于含血清条件下的转染效率,转染成功的细胞在体外持续培养2个月以上未见明显的荧光消减。转染后的细胞可在大鼠纹状体存活并持续表达绿色荧光蛋白2个月以上。提示慢病毒是一种高效的转染人骨髓基质细胞的载体,慢病毒载体介导增强型绿色荧光蛋白基因转染可以作为人骨髓基质细胞的示踪标志用于体内移植研究。     

Sinerem标记大鼠骨髓基质细胞及移植后活体示踪研究

目的初步探索利用欣诺（Sinerem）和转染试剂体外磁性标记大鼠骨髓基质细胞这一方法的可行性,为将来临床上应用MRI追踪标记细胞奠定基础。方法无菌条件下行股骨取骨髓,梯度密度离心法分离获取大鼠骨髓基质细胞,使用Sinerem-多聚赖氨酸复合物（SE—PLL）标记骨髓基质细胞,采用普鲁士兰染色、电镜和台盼蓝排除实验等方法鉴定SE—PLL标记大鼠骨髓基质细胞的效率和细胞的活力,并对SE—PLL标记骨髓基质细胞的增殖和分化能力进行评估。将SE—PLL标记和未标记后的骨髓基质细胞分别移植入大鼠左右侧尾壳核脑内,细胞移植后1、4、7w应用MRI对脑内移植的细胞进行活体示踪,最后利用组织切片进行普鲁士兰染色。结果Sinerem可以高效率地标记骨髓基质细胞,标记效率在99％左右。普鲁士蓝染色显示SE—PLL标记骨髓基质细胞胞质内出现细小的蓝色铁颗粒。电镜结果显示sE—PLL标记的骨髓基质细胞胞质内含有许多包裹铁颗粒的囊泡。与正常未标记的细胞相比较,SE—PLL标记对骨髓基质细胞的活力、增殖和分化等能力没有明显的影响。MRI检查发现脑内移植的标记细胞在磁共振上呈明显的低信号改变,未标记细胞侧脑组织无明显的低信号改变,与组织学切片结果基本一致。结论以上结果提示Sinerem可以用来体外标记骨髓基质细胞,利用MRI技术可以对脑内移植后的标记细胞进行初步的活体追踪。     

内镜下颅底重建的动物实验研究

目的 研究鼻中隔带蒂黏膜瓣修复颅底缺损及放疗对愈后的影响。方法 对10例新鲜白兔尸体的鼻中隔黏膜血供行解剖学研究。将20只健康新西兰大白兔作为实验动物,建立颅底缺损-脑脊液鼻漏模型并利用鼻中隔带蒂黏膜瓣修复颅底缺损,术后7、10d在鼻内镜下观察切口愈合及脑脊液鼻漏情况,术后21d随机抽出10只接受手术治疗的兔子作为实验组行颅脑放疗,其余10只作为对照组,放疗后1、14d实验组和对照组分别于鼻内镜下观察修复区域。 结果7例鼻中隔黏膜瓣血供由鼻中隔后下端进入,2例血供由近鼻中隔后端约1cm处进入,1例未见明显血管分布,成功构建了颅底缺损-脑脊液鼻漏模型并成功实施鼻中隔带蒂黏膜瓣修复颅底缺损手术20例,均全部存活,切口愈合良好,无脑脊液鼻漏,无组织膨出及神经功能缺失等并发症;10只接受术后放疗的兔子及对照组的10只兔子均全部存活,放疗组兔子切口愈合较慢。结论 鼻中隔带蒂黏膜瓣修复颅底缺损的动物实验模型设计可行,放疗对带蒂鼻中隔黏膜瓣有延迟愈合的影响。     

胶质瘤氩氦冻融产物负载树突状细胞对颅内胶质瘤大鼠的免疫治疗研究

目的 观察C6胶质瘤细胞经氩氦冷冻后,冻融产物对Wistar大鼠骨髓源性树突状细胞(BM-DCs)成熟的影响,以及致敏的树突状细胞(DCs)对胶质瘤模型大鼠的抗肿瘤作用. 方法 体外常规培养C6胶质瘤细胞,双循环氩氦冷冻法冻融C6细胞悬液为实验组,只插入探针不作冷冻为阴性对照组,双循环氩氦冷冻法冻融等量PBS为空白对照组;应用重组大鼠白细胞介素-4(rmIL-4)、重组大鼠粒一巨噬细胞集落刺激因子(rmGM-CSF)和肿瘤坏死因子α(TNFα)诱导Wistar大鼠骨髓DCs成熟,培养第7天分别加入各组冷冻产物,48 h后光镜下观察DCs细胞形态,流式细胞仪检测各组DCs细胞表面共刺激分子CD80和CD86的表达,ELISA法检测各组上清液中IL-12含量;将C6细胞接种于Wistar大鼠建立荷脑胶质瘤模型,第3、10天分别皮下注射空白对照组、阴性对照组、实验组DCs疫苗,比较各组大鼠的中位生存期. 结果 培养第7天未成熟DCs加入冷冻产物48 h后实验组具有成熟DCs形态学特征,表面分子CD80、CD86阳性表达率、上清中[L-12的分泌量高于阴性对照组和空白对照组,差异有统计学意义(P＜0.05);实验组DCs疫苗治疗后荷脑胶质瘤大鼠中位生存期高于阴性对照组和空白对照组,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 胶质瘤氩氦冻融产物可以诱导DCs成熟,介导大鼠脑胶质瘤的免疫治疗,为冷冻免疫机制提供一定理论基础,同时该DCs疫苗为胶质瘤个体化治疗的研究提供一种新的方法.     

RAN干扰抑制AQP1表达对Hep-2细胞迁移能力影响的实验

目的通过RNA干扰（RNA interference,RNAi）抑制Hep-2细胞中水通道蛋白-1（aquaporin-1,AQP1）的表达,探讨AQP1对喉癌细胞黏附、运动及侵袭能力的影响。方法构建AQPl特异性的siRNA重组质粒,免疫组化检测RNAi抑制AQP1表达的效果;分别用细胞基质黏附实验、Transwell小室和Matrigel基质侵袭实验检测细胞黏附、运动和侵袭能力。结果AQP1-siRNA重组质粒有效的抑制了Hep-2细胞中AQP1的表达。细胞基质黏附实验结果显示：Hep-2细胞与细胞外基质的黏附率,AQP1-siRNA实验组为（41．6±4．2）％与阴性对照组（43．6±3．9）％和空白对照组（45．2±4．0）％无明显差异（尸均〉0．05）;体外细胞运动和侵袭实验结果显示：Hep-2的穿膜细胞数,实验组分别为（36±3）和（23±4）个／高倍镜,显著低于空白对照组的（70±5）和（65±4）个,高倍镜以及阴性对照组的（72±4）和（69±4）个／高倍镜（P均〈0．01）,而后两组细胞间运动和侵袭能力方面差异均无显著性（P〉0．05）。结论AQP1 RNAi重组质粒能够阻断AQP1的表达,对Hep-2细胞的黏附力没有影响,但能够抑制喉癌细胞的运动和侵袭能力,与喉癌的转移机制密切相关。     

内镜下治疗鼻内翻性乳头状瘤89例临床分析

目的 探讨内镜下治疗鼻内翻性乳头状瘤(nasal inverted papilloma,NIP)的疗效.方法 回顾性分析2003年5月至2008年5月接受鼻内镜手术的89例NIP患者的临床资料.根据鼻内镜与CT和(或)MRI检查,明确病变范围,按Han(2001)的NIP临床分级标准,进行临床分级,并进行随访.结果 对89例NIP患者随访1～5年,其中鼻内镜手术72例,复发率为12.5%(9/72);鼻内镜联合改良柯-陆术式17例,复发率为11.8%(2/17).不同手术方式患者的复发率差异无统计学意义(X~2=0.007,P>0.05).89例NIP患者中Ⅰ级55例,复发率为9.1%(5/55);Ⅱ级29例,复发率为17.2%(5/29);Ⅲ级5例,复发率为20%(1/5),不同临床分级患者的复发率差异无统计学意义(P>0.05).89例NIP患者中首次手术67例,复发率为7.5%(5/67),二次手术22例,复发率为27.3%(6/22),差异有统计学意义(X~2=4.311,P<0.05).89例NIP患者中术后病理证实肿瘤切缘阴性70例,复发率8.6%(6/70),切缘阳性19例,复发率26.3%(5/19),两组差异无统计学意义(X~2=2.860,P=0.09).结论 鼻内镜下行NIP切除术是一种切实可行的方法 ,手术创伤小,可基本完整保留鼻腔、鼻窦正常的解剖结构,但仍有一定的复发率.手术切缘黏膜组织病理学检查可在一定程度上判断肿瘤的预后.     

亚低温防治脑血管痉挛的实验研究

目的　研究兔蛛网膜下腔出血 (Subarachnoidhemorrhage ,SAH)后脑血管痉挛的发生发展过程和脑实质温度变化 ,探索亚低温对痉挛血管的影响和作用机制。方法　通过“枕大池二次注血”制作兔SAH模型并予亚低温处理。结果　33～ 35℃亚低温对SAH后动物生命体征无影响 ,却显著降低SAH后脑血管痉挛 (Cerebralvasospasm ,CVS)的频度和强度。结论　SAH后早期实施亚低温能有效抑制痉挛血管由功能改变向结构改变的转化 ,减轻血管组织的病理损害。     

转染肿瘤坏死因子α及其突变体基因对H22肿瘤细胞体内致瘤能力的影响

目的:比较转染野生型TNF-(Wt-TNF)及多种突变体,包括分泌型TNF-α突变体(S-TNF^m)、跨膜型TNF-α突变体(TM-TNF^m)基因后,H2 2细胞体内致瘤能力,并探讨其可能的机制。方法:将表达TNF-α及其突变体的H22细胞分别与未转染基因的H22细胞以不同比例混合,2.5× 10⁵(10 0 μL)接种于小鼠体内,观察肿瘤的生长情况;并用免疫组化检测肿瘤局部淋巴细胞浸润和肿瘤细胞表达Fas和CD44V。结果:转染TNF-α及其突变体基因的肿瘤细胞的致瘤能力均明显减弱(P <0.0 1);除二型TNF对瘤细胞的胞毒效应外,TM-TNF^m 可诱导肿瘤细胞表达死亡受体Fas,而S-TNF^m 则可明显促进肿瘤灶局部淋巴细胞的浸润(P <0.01)。此外,注射H2 2/S-TNF^m细胞,小鼠出现一过性体重下降。结论:转染TM-TNF^m 和S-TNF^m 基因肿瘤细胞的致瘤能力明显降低,其原因除与二者胞毒效应有关外,前者可能通过Fas途径导致瘤细胞凋亡,后者则可能通过募集和激活淋巴细胞发挥抗瘤作用.     

基质金属蛋白酶-2和基质金属蛋白酶-9与脑缺血

短暂性或持久性脑缺血可诱导基质金属蛋白酶 (MMP)表达 ,大脑中动脉闭塞 再灌注(MCAO R)实验动物模型研究显示 ,基质金属蛋白酶 2 (MMP 2 )和MMP 9含量及活性与缺血性脑损伤关系密切。MMP的表达及活性有望成为一种治疗缺血性脑损伤的手段。