人疱疹病毒6型感染与口腔鳞癌相关性的研究

目的 :研究人疱疹病毒 6型 (HHV 6)感染与口腔鳞癌的关系。方法 :用间接免疫荧光试验及聚合酶链反应 ,分别检测口腔鳞癌和对照组患者血清中抗HHV 6IgG及外周血单个核细胞中HHV 6DNA序列 ;用免疫组化染色法 ,检测口腔鳞癌组织标本中HHV 6抗原。结果 :16例口腔鳞癌患者和 16例其他口腔疾病患者血清中抗HHV 6IgG的阳性率分别为 10 0 .0 %和 75 .0 % ,几何平均滴度分别为 1∶118和 1∶64 ,差异有显著意义 (P <0 .0 5 )。上述 2组患者HHV 6DNA的检出率分别为 62 .5 %和 12 .5 % (P <0 .0 5 )。其中 12例口腔鳞癌组织标本经免疫组化染色检测 ,9例 ( 75 % )HHV 6抗原阳性 ,而 8例对应癌旁组织中 ,阳性者仅 2例( 2 5 % ) ,两者间差异有显著性 (P <0 .0 5 )。结论 :HHV 6可能是口腔鳞癌发生的诱因 ,在肿瘤发生发展中起一定作用     

通过比较基因组杂交研究肝癌中非随机染色体畸变

目的:研究肝癌发生和发展过程中非随机染色体畸变情况。方法:采用比较基因组杂交法(comparativegenomichybridization,CGH)分析25例肝癌标本。结果:4q、8p、16q、17p、13q和6q区域的缺失以及8q、1q、6p和17q区域的扩增为肝癌的特征性变化。结论:非随机改变区域存在的相关基因与肝癌发生有关。     

含EB病毒LMP2A毕氏酵母表达载体的构建与表达LMP2A蛋白的检测

目的：构建EB病毒潜伏膜蛋白2A的表达载体，并在真核生物毕氏酵母细胞中表达。方法：用EcoR Ⅰ和Not Ⅰ将含LMP2A全长编码基因的质粒PCIcc双酶切后，克隆到毕氏酵母载体PICZαA中，构建重组表达质粒pPICαA—LMP2A。pICZαA—LMP2A经SAC Ⅰ酶切线性化，采用氯化锂的方法转化毕氏酵母GS115，经YPD平板Zeocine抗性筛选获得LMP2A阳性克隆的菌株，用PCR鉴定阳性酵母转化子，并分别将阳性的酵母转化子在BMGY和BMMY培养基中进行诱导表达，表达产物进行SDS—PAGE电泳和westem—b10tting分析。结果：重组质粒pPICZαA—LMP2A经PCR和酶切鉴定为阳性。SDS—PAGE电泳和west-em-blotting结果显示表达蛋白的相对分子量为54Kda，与预计值相同。结论：构建了LMP2A毕氏酵母表达载体，并在酵母细胞中成功表达。     

人类疱疹病毒6型U94基因克隆?表达?纯化及抗体制备

目的:制备人类疱疹病毒6型U94蛋白及其抗体.方法:PCR扩增U94基因,经测序后克隆到原核表达载体PGEX-6p-1中.重组质粒转化大肠杆菌Rosetta,诱导蛋白表达.应用酶切鉴定、SDS-PAGE及Western blot等方法确保基因片段的正确性及表达蛋白的特异性.表达的蛋白经亲和层析纯化.纯化的蛋白免疫动物制备抗血清.结果:成功地获得了高纯度的U94融合蛋白,纯度可达90%以上.用其制备多克隆抗体滴度可达1:100 000.结论:获得高纯度的U94融合蛋白及其高效价的抗体.     

2′—5′寡腺苷酸抗病毒作用的重要意义

2′—5′寡腺苷酸是干扰素作用于细胞后产生的物质,其中主要为PPPA_2′P_5′A_2′P_5′A(2′—5′P_3A_3)。干扰素有抗病毒作用,而2′—5′P_3A_3有否抗病毒作用呢?本研究用CaCl_22和2′—5′P_3A_3结合物引入胚皮肤肌肉纤维母细胞,发现它能广泛地抑制病毒的复制,从而对被病毒感染的许多细胞均有一定的保护作用。我们所用RNA病毒包括流感病毒A_3(77—38)、A_1(77—78)、仙台病毒、鼻病毒、人     

人类疱疹病毒6型与口腔恶性肿瘤相关性的研究

目的：研究人类疱疹病毒6型（HHV-6）的感染与口腔恶性肿瘤的相关性及其在临床诊疗中的意义。方法：运用巢式PCR技术,对40例口腔恶性肿瘤患者的血液、唾液、癌组织、正常组织及加例正常对照人群血液、唾液中人类疱疹病毒6型DNA进行检测分析。结果：恶性肿瘤组和对照组唾液中HHV-6 DNA阳性率分别为85．0％、45．0％,其差别具有统计学意义（P〈0．01）;两组血液中HHV-6检出阳性率分别为67．5％、22．5％,其差别亦具有统计学意义（P〈0．01）。两组唾液中的阳性检出率均大于血液。癌组织阳性检出率（78．95％）显著大于正常组织（10．53％）,具有统计学意义（P〈0．01）。结论：进一步证实了唾液腺是HHV-6长期潜伏和增殖的部位,唾液是其主要的传播媒介,为临床简便有效诊断提供参考。HHV-6感染与口腔恶性肿瘤之间存在相关性,可能参与肿瘤发生、细胞癌变的过程。     

EB病毒LMP2A在鼻咽癌患者肿瘤组织中的表达及意义

目的：观察EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白2A(LMP2A)在鼻咽癌(NPC)患者肿瘤组织中的表达,探讨采用LMP2A作为靶抗原进行NPC免疫治疗的可行性。方法：采用SP免疫组织化学方法,检测40例NPC组织及38例鼻咽黏膜慢性炎症组织标本LMP2A的表达。结果：40例NPC标本中36例LMP2A表达阳性(90．0％);LMP2A的表达与NPC病理分化程度无明显相关性。38例鼻咽黏膜慢性炎症组织标本中33例LMP2A阴性反应,5例阳性反应。鼻咽黏膜慢性炎组织与NPC组织中LMP2A阳性表达率间差异存在统计学意义。结论：在不同病理分化程度的NPC肿瘤组织中LMP2A均可广泛表达,在正常鼻咽组织细胞中基本不表达。采用LMP2A作为靶抗原诱导机体特异性细胞免疫反应杀伤NPC肿瘤细胞具一定可行性。     

EB病毒潜伏膜蛋白2A诱导细胞毒性T细胞抗鼻咽癌的体内外实验

目的观察EB病毒（Epstein—Barr virus，EBV）-潜伏膜蛋白2A（1atent membrane protein2A，LMP2A）转染人树突状细胞（dendritic cell，DC）诱导特异性细胞毒性T细胞（cytotoxicity T lymphocyte，CTL）的体外生物学特性；建立表达EBV—LMP2A的裸鼠鼻咽癌动物模型，探讨LMP2A特异性CTL在荷瘤鼠体内的抗肿瘤效应。方法分离人外周血单核细胞（pripheral blood mononuclear cell，PBMC），以粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte—monocyte colony stimulating factor，GM—CSF）、白细胞介素4（interleukin-4，IL4）及肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor-α，TNF—α）诱导培养获得DC，荧光激活细胞分选仪（fluorescence activated cell sorter，FACS）检测成熟DC的表面分子表达。用LMP2A重组腺病毒转染成熟DC，将转染DC与自体PBMC混合培养，在白细胞介素2（interleukin-2，IL-2）作用下诱导针对LMP2A的特异性CTL，FACS检测CTL群体中阳性细胞的组成。将鼻咽癌CNE细胞接种BALB／c裸鼠，建立鼻咽癌动物模型；在裸鼠肿瘤局部注射LMP2A特异性CTL，观察治疗后移植瘤生长情况及病理变化。结果人外周血PBMC体外在GM—CSF、IL4、TNF—α诱导下获得典型形态及表型特征的成熟DC。FACS检测表明，以LMP2A重组腺病毒转染DC诱导的CTL细胞群体以CIM、CD8阳性细胞组成为主。在接种CNE细胞3周后建立表达EBV—LMP2A的裸鼠鼻咽癌动物模型；动物体内实验表明注射CTL的裸鼠肿瘤生长缓慢，体积明显小于对照组（P〈0．01）；病理检查显示肿瘤局部发生液化性坏死并有淋巴细胞浸润。结论人外周血单核细胞体外经细胞因子诱导，可生成具典型特征的成熟DC。利用LMP2A重组腺病毒将LMP2A基因转入DC，可在同一个体体外诱导出针对LMP2A的特异性CTL。CNE细胞接种裸鼠，可成功构建鼻咽癌动物模型；LMP2A特异性CTL在动物体内可明显抑制鼻咽癌肿瘤的生长，发挥有效的抗肿瘤作用。     

人类疱疹病毒6A亚型DR7基因对神经胶质瘤细胞U87增殖､迁移､侵袭能力的影响

目的:构建含人类疱疹病毒6A亚型DR7基因的慢病毒,研究DR7基因表达对神经胶质瘤细胞U87增殖?迁移?侵袭能力的影响?方法:PCR扩增DR7基因,克隆至慢病毒载体pLenti6.3-MCS-IRES2-EGFP,构建pLenti6.3-DR7-IRES2-EGFP重组慢病毒载体,经293T细胞包装重组病毒转染至神经胶质瘤细胞U87,经blasticidin筛选建立稳定表达株,通过细胞增殖实验?细胞周期实验?细胞划痕及Transwell实验研究稳定表达DR7基因对U87细胞的增殖?迁移及侵袭能力的影响?结果:成功构建了pLenti6.3-DR7-6 × His-IRES2-EGFP慢病毒表达载体,筛选了稳定表达DR7基因的U87-DR7-EGFP细胞株,CCK-8细胞增殖实验显示,稳定表达DR7基因的U87-DR7-EGFP细胞与阴性对照细胞U87-NC-EGFP?U87细胞相比,细胞增殖活性明显增高,差异具有统计学意义(P < 0.001)?细胞周期检测发现U87-DR7-EGFP细胞S?G2/M期细胞所占比例多于U87-NC-EGFP?U87细胞:S期的比例分别为(34.73 ± 1.12)%?(24.89 ± 0.93)%?(25.39 ± 0.96)%,差异具有统计学意义(P < 0.001);G2/M期分别为(17.35 ± 1.61)%?(11.36 ± 1.50)%?(13.17 ± 1.95)%,差异具有统计学意义(P < 0.05)?细胞划痕实验表明,U87-DR7-EGFP细胞愈合能力明显强于U87-NC-EGFP?U87细胞,划痕6 h愈合率分别为:(33.55 ± 2.83)%?(23.50 ± 3.18)%?(22.03 ± 1.47)%,差异具有统计学意义(P < 0.01);划痕12 h愈合率分别为(70.50 ± 5.39)%?(53.60 ± 4.67)%?(55.09 ± 2.83)%,差异具有统计学意义(P < 0.001)?Transwell实验表明,U87-DR7-EGFP细胞的穿膜数量明显多于U87-NC-EGFP?U87细胞,分别为:(543.00 ± 22.94)?(387.00 ± 15.63)?(412.00 ± 20.30)个,差异具有统计学意义(P < 0.001)?结论:人类疱疹病毒6A亚型DR7基因表达能在体外促进人神经胶质瘤细胞U87增殖?迁移及侵袭,提示其在神经胶质瘤的发生和发展中可能起一定作用?     

口腔鳞癌患者淋巴细胞对人疱疹病毒6型增殖应答受损

目的研究口腔鳞癌患者淋巴细胞对人疱疹病毒6型（HHV-6）特异性增殖应答,初步探讨HHV-6在口腔鳞癌发病机制中的作用。方法间接免疫荧光法（IIF）检测血浆中抗HHV-6IgG;免疫微磁珠分离CD4^＋T及CD8^＋T细胞;3H-TdR法检测CD4^＋T和CD8^＋T细胞及PBMCs的增殖水平;FACS分析CD4^＋C25^＋调节性T细胞（Treg）的比例。结果口腔鳞癌组血浆中抗HHV-6IgG阳性数为8/8,正常对照组为12例（12/20）;口腔鳞癌组PBMCs及CD4^＋T细胞对HHV-6的增殖水平显著低于HHV-6潜伏感染组与未感染组（P〈0.05）;HHV-6潜伏感染组PBMCs及CD4^＋T细胞对HHV-6的增殖水平显著低于未感染组（P〈0.05）;口腔鳞癌组外周血中CD4^＋C25^＋Treg比例明显高于HHV-6潜伏感染组与未感染组（P〈0.05）。结论口腔鳞癌患者的HHV-6特异性CD4＋T细胞增殖应答减弱,可能在口腔鳞癌的发生发展中起一定作用。