人巨细胞病毒对巨核细胞生长的影响及其反义寡核苷酸的抗病毒活性

目的探讨人巨细胞病毒(HCMV)对人巨核系祖细胞的抑制作用及其机制,初步研究HCMV反义寡核苷酸(ASON)的抗病毒感染作用。方法采用体外悬浮培养巨核系细胞,观察HCMV AD169株对巨核系祖细胞生长的影响。用流式细胞术检测HCMV感染巨核系细胞上HCMV pp65抗原的表达。用HCMV感染经ASON预处理的巨核细胞,计数存活巨核细胞数,用FACS检测巨核细胞上HCMV pp65蛋白表达,并用MTT法测定ASON的细胞毒性。结果HCMV AD169株在体外能明显抑制巨核系祖细胞的增殖,悬浮培养第12天,与对照组相比,HCMV感染组的巨核细胞数减少了67.86%(P<0.05)。HCMV感染的巨核系细胞有HCMV pp65抗原的表达,其表达率为(24.5±3.1)%。0.08μmol/L的UL36反义寡核苷酸(UL36Anti)能对抗HCMV的作用,使巨核细胞数保持在未被感染时的水平,与HCMV感染组巨核细胞数比较有显著差异(P<0.05)。UL36Anti组巨核细胞上几乎无HCMV pp65蛋白的表达。MTT结果表明UL36Anti显著影响细胞生长的浓度为90μmol/L。结论HCMV感染引起的血小板减少与其抑制巨核系祖细胞增殖有关。特异的ASON有一定的抗HCMV活性,有可能作为一种新的手段用于HCMV感染引起的血小板减少症的防治。     

同型半胱氨酸诱导血管平滑肌细胞组织因子表达增强

目的: 研究同型半胱氨酸（Hcy）诱导人血管平滑肌细胞（VSMCs）组织因子（TF）表达的作用，及其对核转录因子（NF-κB）活性和诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达的影响。 方法: 培养人脐动脉VSMCs，将不同浓度的Hcy和/或NF-κB抑制剂PDTC与VSMCs孵育不同时间，用RT-PCR方法检测TF mRNA表达，用Western blotting检测核NF-κB水平，用流式细胞术（FCM）检测细胞表面TF蛋白水平和iNOS水平。 结果: 10 μmol/L Hcy作用4 h，TF表达开始升高，500 μmol/L达峰值，Hcy能显著诱导VSMCs表达TF mRNA；对照组VSMCs细胞膜表面有低水平的TF蛋白表达，10 μmol/L Hcy作用4 h即可诱导VSMCs表达TF蛋白，500 μmol/L 达高峰，Hcy能显著诱导VSMCs表达TF；500 μmol/L Hcy作用1 h，细胞核NF-κB水平明显升高，Hcy可诱导VSMCs NF-κB活化;NF-κB抑制剂PDTC可明显抑制Hcy对TF mRNA和细胞TF表达的诱导作用；单独Hcy作用不能诱导VSMCs表达iNOS。 结论: Hcy能显著诱导VSMCs表达TF，增强VSMCs的NF-κB活化，从而介导TF基因表达和蛋白合成，通过NF-κB介导VSMCs表达TF可能是Hcy导致AS、血栓形成的重要机制。     

呼吸道合胞病毒毛细支气管炎患儿IL4/IFNγ水平变化及意义

为研究Th1/Th2类细胞因子 (CK )在呼吸道合胞病毒毛细支气管炎 (RSV毛支 )发病中的作用 ,本文采用酶联免疫吸附试验 ,对 2 0例RSV毛支患儿和 15例健康婴幼儿外周血单个核细胞 (PBMC )经植物血凝素 (PHA )刺激培养后 ,测定上清液中某些细胞因子 ,并同时检测患儿血浆总IgE水平。实验结果表明 :(1)经PHA刺激培养后 ,RSV毛支组上清液中IL 4,IFN γ水平及IL 4/IFN γ比值与对照组比较 ,差异有显著性 (P <0 0 1、 0 0 5、 0 0 1)。RSV毛支组血浆总IgE水平较对照组明显升高 (P <0 0 1) ;(2 )相关分析 :培养上清液中IL 4水平 ,IL 4/IFN γ比值与血浆总IgE水平间呈显著正相关 ,IFN γ与IgE间呈显著负相关。此外IL 4与IFN γ间呈显著负相关。结果提示 ,RSV毛支患儿存在Th1/Th2功能紊乱 ,主要表现为Th2细胞功能亢进 ;IL 4、IFN γ参与了RSV感染时的免疫病理机制。     

CD40与慢性特发性血小板减少性紫癜免疫发病机制关系的初步研究

目的:了解慢性特发性血小板减少性紫癜(CITP)患者骨髓、血液中B淋巴细胞协同刺激因子CD40的表达情况,从而进一步了解CITP的免疫学发病机制。方法:采用流式细胞术检测CITP患者的骨髓及末梢血的淋巴细胞协同刺激因子CD40的表达,并用ELISA方法检测血液中的PAIgG。结果:CITP组末梢血B淋巴细胞CD40表达率(13.81%±2.98%)明显高于正常对照组(6.31%±1.24%),两者比较差异有统计学意义(P<0.01);CITP组骨髓B淋巴细胞CD40表达率(23.65%±3.25%)也明显高于正常对照组(8.32%±2.34%),两者比较差异亦有统计学意义(P<0.01);CITP患者的外周血B淋巴细胞CD40表达率与PAIgG水平两者间呈显著的正相关(r=0.92,P<0.05)。结论:CD40在CITP患者淋巴细胞的表达异常增高,可能是CITP发病的免疫学机制之一。     

Homocysteine-induced Enhanced Expression of Tissue Factor in Human Vascular Smooth Muscle Cells

The homocysteine (Hcy)-induced tissue factor (TF) expression in human vascular smooth muscle cells (VSMCs) and the effect of Hcy on the activity of nuclear factor-kappaB (NF-кB) and the expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) were investigated. Human umbilical artery VSMCs were cultured by tissue explanting method, identified by α-actin immunohistochemistry, and incubated with different concentrations of Hcy/PTDC (NF-кB inhibitor). Semi-quantitative RT-PCR was performed to detect the expression of TF mRNA in VSMCs. Flow cytometry was used to assay the expression of TF protein on the surface of VSMCs and the expression of iNOS in VSMCs. Western blot was carried out to detect the expression of NF-кB protein in nuclei. The results showed that Hcy could induce VSMCs expressing TF mRNA significantly after the VSMCs were incubated with Hcy at concentrations of 10, 100, 500 μmol/L respectively. There was low expression level of TF protein on the surface of the resting VSMCs and Hcy could also induce VSMCs expressing TF pro- tein on the cell surface in different concentrations. Additionally, Hcy could rapidly induce the activation of NF-кB and this effect could be significantly inhibited by PDTC. Hcy alone could not induce the expression of iNOS in VSMCs. It was concluded that Hcy could significantly induce the expression of TF in VSMCs and enhance the activation of NF-ΚB, subsequently mediate TF gene expression and protein synthesis. NF-кB-mediated expression of TF in VSMCs might be the important mechanism of atherosclerosis and thrombosis induced by Hcy.     

人巨细胞病毒感染巨核祖细胞及反义寡核苷酸抗病毒感染作用的研究

目的探讨人巨细胞病毒 (HCMV)对人巨核细胞及其前体细胞的抑制作用及其机制 ,并观察HCMV反义寡核苷酸 (ASON)的抗病毒感染作用。方法在半固体培养基上定向诱导CD34 细胞向巨核细胞分化。用HCMVAD16 9病毒株感染培养的巨核细胞和经ASON预处理的CD34 细胞 ,观察CFU MK形成率的变化 ,分别用PCR、RT PCR法检测CFU MK细胞中HCMV即刻早期蛋白 (IEP)基因DNA和mRNA、即刻早期基因 (UL36 )mRNA表达。用MTT法测定ASON的细胞毒性。结果CD34 细胞在半固体培养基中定向分化为巨核祖细胞。HCMVAD16 9株能明显抑制巨核细胞的体外增殖 ,与灭活病毒组比较 ,三个不同病毒滴度感染组的CFU MK分别减少了 2 1.6 %、33.8%、4 6 .3% ,显示抑制程度与病毒感染滴度呈剂量依赖关系 ;HCMV感染的CFU MK细胞中可检出HCMVIEP基因DNA、IEP基因mRNA和UL36mRNA。 0 .0 8μmol/L的UL36ASON (UL36Anti)能使HCMV感染细胞CFU MK形成率恢复正常 ,与 10 0 0 0TCID50 HCMV感染组比较 (分别为 5 8.2 4± 7.4 2和 31.17± 4 .4 5 ) ,差异有显著性 (P<0 .0 5 ) ,RT PCR未能检出UL36mRNA。而改变UL36Anti中 1个碱基的ASON(MM1) ,浓度只有达到 0 .4 0 μmol/L才能对抗HCMV的作用。MTT结果表明UL36Anti显著影响细胞生长的浓度为 90 .0 0 μmol/L。结     

人巨细胞病毒对人巨核系祖细胞体外生长的影响

目的：探讨人巨细胞病毒（HCMV）对人巨核系祖细胞（CFU－MK）的抑制作用及其机制。方法；采用体外半固体培养技术，观察4种不同浓度HCMV AD169株对CFU－MK集落生长和成熟的影响。分别用PCR和RT－PCR检测集落细胞中HCMV即刻早期（IE）蛋白DNA与即刻早期(IE)蛋白mRNA。结果：HCMV AD169株在体外能明显抑制CFU－MK集落生长，3个感染组的CFU－MK集落数均减少，与灭活病毒组比较，集落数减少程度分别为21.6%、33.8%、46.3%（P＜0.05），显示抑制程度与病毒感染滴度虽剂量依赖关系；RT－PCR检测发现HCMV感染组CFU－MK细胞有IE蛋白mRNA的表达；PCR检测发现HCMV感染组CFU－MK细胞中有IE蛋白DNA。结论：HCMV AD169株在体外能抑制CFU－MK的分化和增殖，提示HCMV感染引起的血小权减少与CFU－MK受HCMV抑制有关，并证实HCMV感染的CFU－MK集落细胞中存在HCMV IE蛋白的早期转录。     

聚乳酸纳米粒介导decoy片段调控大鼠脑微血管内皮细胞组织因子表达的体外研究

目的 探讨由聚乳酸纳米粒包裹的核因子（NF）-κB decoy寡核苷酸片段对体外培养的大鼠脑微血管内皮细胞组织因子表达活性的调控功能。方法 以聚乳酸为材料，纳米沉积法制备载荧光标记NF-κB decoy-纳米粒混悬液，检测其物理表征、包封率和体外释放情况：共聚焦显微镜和流式细胞术观察和检测培养的脑微血管内皮细胞摄取decoy-纳米粒的效率和细胞内分布，运用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）及Western blot技术分别比较摄取纳米粒的细胞在脂多糖（LPS）刺激下TF mRNA和P65表达的变化。结果 制备的decoy-纳米粒平均粒径为162．1nm，多分散指数为0．118，体外释放实验显示经28d其总释放率达92．3％，流式细胞术检测到细胞对decoy-纳米粒摄取随浓度和作用时间的增加而增加，被摄取的decoy-纳米粒位于细胞胞浆内，RT-PCR结果提示经纳米粒包载的NF-κB decoy具有生物活性，可以显著抑制LPS作用下脑微血管内皮细胞的TF表达水平，Western blot结果显示核提取物中P65的表达显著降低。结论 聚乳酸纳米粒能将NF-κB decoy寡核苷酸片段递送至细胞内，且能保持生物活性，该方法为脑血栓病基因治疗提供了依据。     

胃癌和食管癌外周血CD4+CD25+调节性T细胞检测及其临床意义

目的 探讨胃癌和食管癌外周血表达CD25的CD4+调节T细胞(CD4+CD25+Tr)比率变化的特点及其临床意义.方法 采用流式细胞术检测49例胃癌和28例食管癌患者外周血CD4+CD25+调节T细胞水平,并进行分层分析.结果 食管癌患者外周血CD4+CD25+Tr细胞占总CD4+T细胞的(24.37±4.82)%(n=28);胃癌患者外周血CD4+CD25+Tr细胞占总CD4+T细胞的(17.74±4.24)%(n=49).与健康对照组比较,外周血CD4+CD25+Tr细胞比率均明显升高,差异有显著统计学意义(P＜0.01).该CD4+CD25+Tr细胞低表达CD45RA及CD69.分层分析外周血CD4+CD25+Tr细胞比率与肿瘤临床分期的关系显示,胃癌患者Ⅰ～Ⅲ期,其外周血CD4+CD25+Tr细胞占CD4+T细胞的比率为(16.69±5.71)%(n=15);Ⅳ期为(18.08±4.99)%(n=16).与Ⅰ～Ⅲ期比较,Ⅳ期患者外周血CD4+CD25+Tr细胞比率升高,但是,差异无统计学意义(P＞0.05).胃癌复发患者18例,其外周血CD4+CD25+Tr细胞占CD4+T细胞的比率为(23.32±4.98)%(n=18).明显高于原发胃癌组(P＜0.01).食管癌患者Ⅰ-Ⅲ期外周血CD4+CD25+Tr细胞占CD4+T细胞的(25.17±5.87)%(n=18),Ⅳ期患者外周血CD4+CD25+Tr细胞占CD4+T细胞的(26.46±4.84)%(n=10),差异无统计学意义(P＞0.05).结论 胃癌和食管癌患者外周血CD4+CD25+Tr细胞比率明显升高.提示祛除人的CD4+CD25+Tr细胞是一种有效的治疗肿瘤的新方法.     

恶性肿瘤患者CD4+CD25+/CD4+CD25high调节性T细胞的研究

目的：探讨恶性肿瘤患者外周血CD4^＋CD25^＋/CD4^＋CD25^high调节性T细胞（Regulatory T cell，Treg）水平的特点及其临床意义。方法：采用流式细胞术检测Treg水平，并进行分层分析。结果：62例恶性肿瘤患者外周血中CD4^＋CD25^＋/CD4^＋CD25^high Treg占T细胞的百分比分别为19.61%±8.17%和4.20%±1.90%，高于正常对照组（分别为P〈0.05和P〈0.001），它们与NK细胞呈负相关（r分别为-0.2361和-0.306）。随疾病进展，CD4^＋ CD25^＋Treg水平升高，肿瘤进展期（IV期）与前3期比较有极显著差异（P〈0.001）。CD4^＋CD25^high Treg占CD4＋T细胞的百分比率逐渐升高，中期（Ⅲ期）患者与早期患者、正常对照组比较有极显著差异（P〈0.001）；晚期患者与中期患者比较有极显著差异（P〈0.001）。结论：恶性肿瘤患者外周血CD4^＋CD25^＋/CD4^＋CD25^high Treg水平的升高，与恶性肿瘤免疫功能低下及肿瘤的发生发展密切相关。