siRNA沉默水通道蛋白4治疗创伤性脑水肿的实验研究

【目的】应用鼠脑创伤模型观察靶向水通道蛋白4（Aquaporin4,AQP-4）的小RNA干扰（siRNA）技术对脑水肿的治疗效果。【方法】构建沉默AQP-4mRNA表达的siRNA质粒;液压打击法建立大鼠脑创伤（traumaticbraininjury,TBI）模型,分TBI组、空载质粒组和AQP-4siRNA治疗组;提取第1、3、5、7天脑组织总RNA,RT—PCR方法检测AQP-4的mRNA表达;干／湿比重法和Evans蓝测定法观察大鼠TBI后不同时相脑组织含水量和血脑屏障通透性改变;实验动物予以神经功能缺陷综合评分。【结果】RT—PCR结果显示siRNA质粒可有效沉默AQP-4在受损脑组织的表达;与TBI组和空载质粒组比较,AQP-4siRNA治疗组在减少受损脑组织含水量、降低血脑屏障通透性,以及改善动物神经功能方面均有明显好转,各检测时间点与TBI组和空载质粒组比较均存在统计学差异（P〈0．05）。【结论】靶向AQP-4的siRNA技术通过对AQP-4的有效沉默可明显减轻TBI后的脑水肿程度,发挥良好的治疗效果。     

机械碎栓、支架取栓联合动脉注射rt-PA治疗急性脑血管闭塞的疗效观察

目的 评价动脉途径给予rt-PA结合微导丝、微导管机械碎栓、Solitaire AB支架对急性脑血管闭塞的临床效果及安全性.方法 回顾性分析2010年10月至2012年3月收治的42例应用rt-PA结合微导丝、微导管机械碎栓和(或)Solitaire AB支架治疗的急性脑血管闭塞患者的临床资料.结果 42例患者闭塞脑血管完全或部分再通,再通率为100％;其中37例完全再通,完全再通率88％.术后1例发生基底节区脑出血,1例发生蛛网膜下腔出血,1例出现昏迷并持续高热,于术后8d死亡.9例(21％)经后期内科治疗后遗留不同程度的神经功能障碍.术前和术后不同时间NIHSS评分及ADL评分相比差异有统计学意义(P＜0.05).结论 对治疗时间窗内的急性脑血管闭塞患者,微导管、微导丝机械性碎栓和(或)Solitaire AB支架结合动脉内注射rt-PA治疗是安全有效的.     

反义miR-21抑制异种移植U251人脑胶质瘤生长的体内研究

目的 探讨敲低miR-21表达抑制裸鼠荷皮下U251人腩胶质瘤生长的疗效和机制. 方法 原位注射miR-21反义寡聚核苷酸(AS.miR-21)治疗裸鼠皮下荷U251人脑胶质瘤.定时测量肿瘤大小评估原位注射AS-miR-21治疗效果:使用Real time PCR和原位杂交方法鉴定治疗后miR-21表达水平下调;采用HE染色和免疫组织化学染色(PCNA、PTEN、MMPs、和Septins)评价治疗后肿瘤牛物学性状改变;TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡. 结果 肿瘤生长曲线显示AS-miR-21治疗组肿瘤生长速度及体积小于空白对照与无义序列治疗组(F=52.458,P=0.000);Real-time PCR法:AS-miR-21治疗组miR-21表达下调为对照组的0.018±0.009:原位杂交显示AS-miR-21治疗组miR-21表达水平较对照与无义序列治疗组下调:组织病理学检测表明AS-miR-21治疗后肿瘤恶性度降低;TUNEL法检测可见AS-miR-21治疗组细胞凋亡数显著高于对照与无义序列治疗组(F=141.021,P=0.000).结论 以miR-21作为靶点抑制异种移植U251人脑胶质瘤生长,miR-21可能通过上调抑癌基因PTEN抑制胶质瘤的生长,可以作为人脑胶质瘤基因治疗的侯选靶点.     

骨髓间充质干细胞对胶质瘤趋向性的研究

目的 利用体内、外迁移模型观察骨髓间充质干细胞对胶质瘤的趋向性。方法 体外应用圆环柱细胞共培养体系、Matrigel细胞球体共培养体系和Transwell双室培养体系模型观察BMSCs向胶质瘤细胞的趋瘤效应。建立颅内c6胶质瘤模型，将预先标记BrdU的BMSCs注射人对侧脑半球。免疫学方法检测BMSCs在胶质瘤内的分布。结果 3种体外模型从不同角度显示了BMSCs的胶质瘤趋向性的存在。体内经对侧注射的BMSCs向肿瘤侧发生迁移，主要分布于包括浸润区和肿瘤小灶在内的肿瘤与正常脑组织交界部位。结论 BMSCs具有明显的胶质瘤趋向性，可作为治疗胶质瘤新的侯选的基因药物投递系统。     

骨髓基质干细胞移植对大鼠胶质瘤局部微环境的影响

目的:探讨骨髓基质干细胞(BMSCs)移植对脑胶质瘤模型大鼠(荷瘤大鼠)胶质瘤的影响。方法:观察BMSCs培养上清液对C6胶质瘤细胞增殖活性、细胞周期的影响。观察脑内移植BMSCs对胶质瘤核增殖抗原(PCNA)表达阳性率、脑内胶质瘤微血管计数的影响及荷瘤鼠生存期的改变。结果:BMSCs培养上清液对胶质瘤细胞增殖没有明显的影响;BMSCs可抑制肿瘤边缘及卫星灶的肿瘤增殖,对肿瘤内部的细胞增殖没有明显影响。移植BMSCs后肿瘤边缘及卫星灶的微血管计数未见明显改变。移植BMSCs后的荷瘤大鼠脑内胶质瘤水肿有所减轻。结论:BMSCs移植可轻度抑制荷瘤鼠脑内胶质瘤细胞的增殖。     

骨髓间充质干细胞向脑胶质瘤趋向性的初步研究

背景骨髓间充质干细胞(MSCs)是存在于骨髓中的非造血类干细胞,具有自我更新及多向分化潜能.在大鼠脑外伤模型中的迁移能力已得到证实,而其对于脑胶质瘤的趋向性的研究尚处于初期.本实验通过将标记的MSCs移植到大鼠脑胶质瘤模型体内,观察它的迁移情况.方法采用全骨髓细胞培养法,利用MSCs的贴壁生长及可在体外长期培养的特性,获取纯化的MSCs.采用流式细胞术鉴定其表面抗原及细胞周期.在处于对数生长期的MSCs培养皿中加入BrdUrd(终浓度10μg/mL),培养24～48 h后进行移植.采用立体定向技术建立大鼠脑胶质瘤模型,3 d后移植标记好的MSCs在大脑半球组,BrdUrd标记的MSCs被注入大鼠脑胶质瘤模型肿瘤对侧大脑;在颈内动脉组,BrdUrd标记的MSCs被注入大鼠脑胶质瘤模型肿瘤同侧的颈内动脉.分别以BrdUrd标记的3T3细胞作为对照组.2周后,处死大鼠取脑组织制作病理切片,进行抗BrdUrd免疫组化及免疫荧光染色,观察MSCs的迁移情况.结果全骨髓培养法获得了纯化的MSCs.移植到脑组织及颈内动脉的BrdUrd标记的MSCs表现出了明显的向脑胶质瘤迁移的特性.在大脑半球组,MSCs主要集中在肿瘤与正常脑组织的交界部位,在瘤内只有少量分布.在颈内动脉组,MSCs主要分布于肿瘤内部,在肿瘤与正常脑组织的交界位置有少量分布.结论MSCs具有明显的向脑胶质瘤迁移的特性,同时亦可通过血脑屏障,有可能成为胶质瘤基因治疗的理想载体.     

水通道蛋白4小RNA干扰技术优化亚低温治疗脑水肿

目的 应用针对靶向水通道蛋白4(aquapofin 4,AQP-4)的小RNA(siRNA)干扰技术优化亚低温减轻颅脑创伤(traumatic brain injury,TBI)后脑水肿程度的治疗效果.方法 构建沉默AQP-4 mRNA表达的siRNA质粒;液压打击法建立大鼠TBI模型,分TBI对照组、AQP-4 siRNA治疗组、亚低温治疗组、AQP-4 siRNA及亚低温联合治疗组;提取第1、3、5、7天脑组织总RNA和总蛋白,RT-PCR和Western blot方法 检测AQP-4的mRNA和蛋白表达水平;干/湿比重法和Evans蓝测定法观察大鼠TBI后不同时相脑组织含水量和血脑屏障通透性改变;实验动物予以神经功能缺陷综合评分.结果 亚低温在减轻TBI后脑水肿程度方面优于AQP-4 siRNA,但siRNA技术在沉默AQP-4表达方面强于亚低温,联合应用AQP-4 siRNA和亚低温在TBI后降低脑水肿程度方面获得最佳治疗效果.结论 靶向AQP-4的Si RNA干扰技术可优化亚低温在TBI后降低脑水肿方面的治疗效果.     

ts-SV40LT抗原转基因干细胞增殖活性的温度调控机制分析

Objective To study the mechanism of temperature control proliferation of the stem cells modified by ts - SV40LT gene for establishing a basement on stem cells transplantation into injured brain area during hypothermia treatment. Methods After transfecting plasmid containing temperature - sensitive simian virus 40 large T - antigen (ts - SV40LT) into umbilical cord mesenchymal stem cells (UCMSCs), PCR method was used to detect gene integration. Then we cultured these UCMSCs modified by ts - SV40LT in 33℃ and 37℃ incubators respectively. Immumofluorescence was used to detect proliferating cell nuclear antigen (PCNA)activity, telomerase activation analysis by PCR- ELISA telomerase detect kit, and cell cycle by flow cytometry.Then cell cycle regulating proteins, including Cyclin D1, CyclinE, CDK2, CDK4, CDK6, P16 and P21, were detected by westerm blot. The expression of nestin, neurone specific enolase (NSE) and glial fibrillary acidic protein(GFAP) were detected by immunofluorescence method. Results The ts - SV40LT gene was integrated into UCMSCs successfully. When cultured at 33℃ incubator, the new cell line displayed high proliferation activity, as well as its telomerase activation, highly expressed Cyclin D1, CyclinE, CDK2, CDK4 and CDK6, and lowly expressed P16 and P21, meanwhile, highly nestin, lowly NSE and GFAP. But when cultured at 37℃ incubator, the cell line showed a completely converse profile. Conclusion The proliferation of stem cells can be regulated by temperature through effective ts -SV40LT gene transfection, and that supports the clinical application of stem cells transplantation into injured brain area during hypothermia treatment.     

脑源性神经营养因子对低温移植干细胞的环境营养与促神经分化作用

我们利用脑源性神经营养因子(BDNF)的营养神经及其易于诱导干细胞向神经元分化的双重作用机制,观察BDNF对亚低温环境下移植干细胞的环境营养作用以及其促进向神经元分化的体内实际效果.