SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR测定猴免疫缺陷病毒RNA拷贝数方法的建立

.学者论坛·在动物实验中解决临床难题···························，·······································································……顾玉东(3)基因〕:程     

重组人干扰素α-2b鼻腔喷雾剂预防治疗恒河猴感染SARS-CoV的试验研究

目的评价重组人干扰素α-2b鼻腔喷雾剂对恒河猴感染SARS-CoV的预防治疗作用。方法采用鼻腔喷雾法(剂量为60万单位/鼻孔)研究了重组人干扰素α-2b鼻腔喷雾剂对感染SARS-CoV的恒河猴预防治疗效果。结果试验组(5只)和对照组(5只)相同时间检测的咽拭子等标本中,Real-time PCR检测和病毒分离均未检出病毒。攻毒后病毒导致机体产生的中和抗体和IgG抗体的反应也较对照组弱。血液学指标检测结果表明试验组动物攻毒后各项指标较试验前比较没有显著性改变;病理结果显示试验组2只恒河猴肺组织形态基本正常,其余3只猴有肺间质性炎,表现肺间隔增厚、单核样细胞为主的炎细胞浸润,其中1只增厚的肺间隔有局灶相互融合,这3只猴肺部病变与对照组的病变表现相似,且病变累及范围较对照组小;其他各受检脏器均未见明显异常。结论重组人干扰素α-2b鼻腔喷雾剂可以有效阻断或减弱SARS-CoV对恒河猴的感染。     

SARS-CoV感染后人ACE2转基因小鼠肺组织一氧化氮合酶的变化

目的利用人血管紧张素转换酶2（ACE2）转基因小鼠模型研究一氧化氮（NO）在严重急性呼吸综合症（SARS）发病中的作用。方法用PUMC01株SARS-CoV感染野生型及人ACE2转基因小鼠,免疫印迹、免疫组化及分光光度法观察两组动物在感染后3、7d肺组织诱导型一氧化氮合酶（iNOS）和血清NO的变化。结果免疫印迹显示,在接种病毒后3d和7d的转基因小鼠肺组织iNOS蛋白密度明显增高。免疫组化显示,接种病毒后3d和7d转基因小鼠肺组织巨噬细胞增多,iNOS表达呈明显的阳性反应。生化测定血清NO结果显示,接种病毒后3d,与攻毒前及相同时间的野生型小鼠相比,NO水平明显升高。结论NO在SARS发病的病理生理过程中可能发挥重要的作用。     

中国恒河猴Mamu-A*01基因筛查及其对抗原肽p11C的特异性CTL反应

目的 筛查中国恒河猴Mamu-A*01基因,比较中国恒河猴和印度恒河猴的Mamu-A*01基因序列和功能是否相同.方法 PCR方法检测128只中国恒河猴,用特异性引物扩增Mamu-A*01基因,将PCR扩增后的产物克隆测序后与印度恒河猴的Mamu-A*01基因进行同源比对;酶联免疫斑点检测 (ELISPOT) 方法分别检测5只Mamu-A*01基因阳性和5只阴性恒河猴针对SIV、SHIV抗原肽p11C的特异性CTL反应.结果 共筛查出5 只Mamu-A*01基因阳性恒河猴 (3.91%),经测序分析后与印度恒河猴的同源性可达99.1 %.这5只均为SIV/SHIV感染恒河猴,其中四只SIV感染的猴的ELISPOT结果显示针对p11C的高频CTL反应,斑点数在500-1400/106 PBMCs之间,而另1只SHIV感染的恒河猴及5只阴性猴没有斑点出现.结论 中国恒河猴含有Mamu-A*01基因,基因频率有区域性差异,中国恒河猴的Mamu-A*01可提呈特异性抗原肽p11C.     

猴B病毒抗体不同检测方法的比对

目的猴B病毒(monkey B virus,BV),也称猴疱疹病毒I型(Cercopithecine herpesvirus 1),是重要的人兽共患病原。根据国家标准,猴B病毒作为抗原检测抗体,但由于生物安全问题,抗原制备受到很大限制,因此使用替代抗原进行抗体血清学检测并进行比对验证。方法应用2种ELISA方法(抗原分别为BV和HVP2)和1种免疫酶法EIA方法(抗原为HSV-1)对本实验室135份送检恒河猴血液样品进行筛查,对阳性及可疑样品再以免疫荧光法IFA和Western blot方法(抗原为HSV-1)以及以HSV-1 g C1纯化糖蛋白为抗原的免疫印迹方法验证。结果HVP2-ELISA、BV-ELISA和HSV-1-EIA阳性检出率分别为32.6%、37.8%和34.8%;3种方法检测结果一致的样品占91.1%(123/135),阳性结果可被IFA和WB确证;可疑样品12份,33.3%(4/12)的样品经验证检验为阳性。结论与BV抗原相比,替代抗原HSV-1的敏感性和特异性较HVP2更为接近;阳性样品及可疑样品的确证检验应使用多种方法,避免漏检。     

急性SIVmac感染猴模型评价中药1号体内抗病毒效果

采用ＳＩＶｍａｃ感染剂量（１～１０ＭＩＤ５０）和先给药后感染方式，中药Ⅰ号能１００％保护动物不发生活动性ＳＩＶ感染，表现在感染治疗后从血浆分离病毒阴性，无可检出的抗体，ＰＣＲ检测ＰＢＭＣＳＩＶｍａｃＤＮＡ阴性，但巢式—ＰＣＲ检测２／３猴阳性。对照组３／４猴建立了真正感染，病毒分离阳性，抗体上升。中ＳＩＶｍａｃ感染剂量（１０～１００ＭＩＤ５０和先感染后给药方式，中药Ⅰ号未能抑制感染后２周的血浆病毒水平，但与对照组比较明显降低感染２周后的血浆病毒水平。表明中药Ⅰ号有抗猴体内病毒的作用。本模型亦可应用于中药方剂猴体内抗病毒的效果评价。     

枸杞子乙酸乙酯提取部位的抗氧化活性研究

【目的】研究枸杞子乙酸乙酯提取部位的抗氧化作用。【方法】采用荧光分光光度法研究其抗羟自由基作用;采用紫外可见分光光度法研究其抗氧自由基作用及氧自由基对红细胞的氧化作用。【结果】枸杞子乙酸乙酯提取部位对.OH有很强的抑制和清除作用,并具有浓度依赖性;可清除邻苯三酚自氧化体系产生的O2-.,对抗O2-.对红细胞的氧化作用。【结论】枸杞子乙酸乙酯提取部位具有较好的抗氧化能力。     

ELISPOT方法检测SIVmac239感染猴特异性细胞免疫水平

目的为了完善现有的SIV／恒河猴模型，掌握恒河猴被SIV感染后体内细胞免疫应答状态，为评价HIV疫苗提供方法和数据上的参考，我们测定了SIV感染猴体内病毒特异性的细胞免疫水平。方法实验前选出4只无SIV、sTLV、SRV／D和B病毒感染的恒河猴，用SIVmac239病毒液静脉感染实验猴，使用RT-PCR、流氏细胞术和ELISPOT等方法，监测SIVmac239病毒在恒河猴体内复制情况、感染猴的外周免疫损伤情况和细胞免疫情况，持续测定一年。结果实验结果显示IFN-γ ELISPOT方法能有效的评估实验猴的细胞免疫情况，IFN—YELISPOT结果和CD4＋T细胞数无相关性，与血浆病毒载量稍有相关。结论本实验明确了SIVmac239感染中国恒河猴体内CTL的基本趋势和范围，了解了外周血病毒载量、外周免疫损伤与细胞免疫状况之间的联系，完善了SIV／SAIDS模型评价指标，为使用此模型评价抗病毒药物或疫苗提供了基础条件。     

超声波均质化对仙台病毒ELISA测试中抗原稳定性的影响

目的研究超声波均质化(homogenization)处理对于仙台病毒在ELISA测试中抗原稳定性的影响。方法对BHK-21细胞内扩增培养的仙台病毒通过差速离心,富集后使用超声波做均质化处理,和未处理的病毒分别包被酶标板,使用标准免疫小鼠血清和SPF小鼠血清对包被平板进行测试,比较样品测试孔间测量数据的变异率。结果对免疫血清做梯度稀释,各梯度样品在未经超声处理仙台病毒抗原包被ELISA检测中测量值的变异率在1.97%～6.02%之间;在经超声处理仙台病毒抗原包被ELISA检测中测量值的变异率在0.53%～2.26%之间;SPF血清测量值的变异率均高于免疫血清;所有样品在经超声处理的病毒抗原包被ELISA检测中测量值的变异率均较小。结论超声波处理有效的提高了仙台病毒抗原的均质性,在ELISA测试中提高了抗原的稳定性。     

H5N1接种恒河猴和食蟹猴后外周血细胞变化的分析

目的 测定H5N1型禽流感病毒感染恒河猴、食蟹猴后,其外周血细胞的变化,为H5N1模型猴提供基础数据及研究参考.方法 健康合格食蟹猴、恒河猴各4只,经滴鼻方式接种H5N1病毒107TCID50,确认发病后,在不同时间点进行血细胞及T淋巴细亚群的分析.结果与接种HSN1病毒前比较,接种后白细胞总数(WBC)在第6天时有所降低,至第9天时回升;红细胞总数(RBC)在第3天有所降低,之后回升;淋巴细胞比例及数量分别在第6天、第9天升高并达到最高值.至第9天时,CD4+T细胞数明显高于接种前,CD8+T细胞数上升显著,导致CD4+/CD8+T细胞比例下降,甚至在2只食蟹猴出现了比例倒置.结论 实验用猴感染H5N1后,可导致WBC,CD+,CD8+T等血液细胞的变化,应作为H5N1模型动物的检测指标.