狂犬病病毒检测历史及研究进展

狂犬病（Rabies）是由狂犬病病毒（Rabies virus）感染温血动物和人的中枢神经系统后引发急性致死性脑脊髓炎的一种人兽共患传染病。狂犬病是迄今为止人类病死率最高的急性传染病之一，无特效的治疗药物，一旦发病，死亡率几近100％。狂犬病主要分布在亚洲、非洲和拉丁美洲等发展中国家。2000多年前，我国就有狂犬病的记载，目前，我国是世界上受狂犬病危害最为严重的国家之一。     

江西省黄鼬和鼬獾狂犬病流行病学监测

目的 为确定江西省除鼬獾外夜行肉食类野生动物黄鼬是否携带狂犬病病毒,对该地区黄鼬和鼬獾进行狂犬病流行病学监测,分析其感染状况。方法 在江西部分地区采集黄鼬和鼬獾脑组织样品,直接免疫荧光法（FAT）检测样品中狂犬病毒抗原,小鼠颅内接种实验（MIT）分离病毒,RT-PCR扩增其核蛋白和糖蛋白全基因进行测定,并与我国其他地区狂犬病病毒的核酸序列进行对比分析。结果 黄鼬脑组织样品FAT结果阳性率为0（0/1 102）,鼬獾阳性率为1.9 %（4/210）。经MIT分离到4株狂犬病病毒之间N基因和G基因的同源性较高,分别为99.6%～100%和99.7%～100%,与浙江和江西其它鼬獾狂犬病病毒分离株同源性为96.0%～99.3%和98.7%～99.1%,与浙江和福建犬源分离株（ZJ-QZ,D01,FJ008,FJ009等）同源性为88.2%～88.8%和87.6%～87.7%。结论 采样地区黄鼬样品中未发现狂犬病病毒感染,而鼬獾感染狂犬病病毒阳性率较高,说明其种群内存在狂犬病的流行;犬与鼬獾狂犬病病毒株同源性较低,二者交叉传播或溢出的可能性较低;黄鼬和鼬獾尽管同属夜行动物,但二者交互感染的可能性很低。有必要对该地区野生动物狂犬病进行长期监测。     

兽医学新进展与发展设想

目的 综述国内外兽医学的研究现状和发展动态,提出未来5年我国军事兽医学的发展设想.方法 采用情报调研方法,检索近5年来国内外兽医学领域的研究论文,总结国内外兽医学科领域取得的新知识、新理论、新技术和新成就,分析国内外重大动物疫病和人兽共患病的防控局势及学科发展趋势.结果 近5年来,兽医学研究的重要学科相互交叉与渗透.随着大规模测序与生物信息学技术的发展,兽医学在病原体的基因组学、蛋白质组学与生物信息研究方面取得了一些高水平成果,为科学研究与创新提供了高效手段.我军兽医工作在科研条件建设、专业人才培训、医学科研等方面取得了重大进展,动物疫病和人兽共患病防控成绩显著.结论 军队兽医要密切跟踪国际最新的理论和技术,重点开展重要疫病的防控技术研究、反向疫苗学和新型基因重组载体的构建和改造、动物性食品安全研究、生物恐怖战剂及其侦检研究.     

犬2型腺病毒的分离鉴定及初步特性分析

目的:从长春市某养殖场一病死幼犬子宫中分离、签定病毒并分析其特性.方法:样品处理物接种MDCK细胞,病变细胞培养物进行电镜负染观察,对分离的病毒进行细胞敏感谱和红细胞血凝谱测试,并以特异引物PCR扩增鉴定,进行动物回归试验,检测分离病毒的理化学特性.结果:子宫上皮组织匀浆物能使MDCK细胞发生腺病毒典型病变,电镜观察可见二十面体立体对称病毒粒子.病毒增殖能被5-碘脱氧尿苷(5-IUDR)所抑制,对乙醚、胰酶不敏感,对酸(pH 3.0)和热(50℃)有一定抵抗力,能凝集人和大鼠红细胞但不凝集豚鼠红细胞,用犬腺病毒(CAV)特异性引物可扩增出与CAV-2阳性对照相同大小的核酸片段.分离病毒经口鼻接种SN效价为0的2月龄以下幼犬.可使其全部发病,其中3只死亡.结论:从病死幼犬子宫分离获得一株腺病毒,PCR扩增证明其为犬腺病毒2型,命名为CC0710.动物回归试验表明,该病毒毒性较强.     

4株狂犬病街毒的分离及其核蛋白和糖蛋白序列分析

目的以4株狂犬病街毒分离株及我国南北方不同地区狂犬病病毒街毒为研究对象,通过其核蛋白及糖蛋白基因的同源性及进化分析,比较我国狂犬病流行毒株与人用及兽用狂犬病疫苗株间的基因及抗原性差异,为相关疫苗的研究奠定理论基础。方法以直接免疫荧光法(DFA)检测疑似狂犬病的犬脑标本,以乳鼠颅内接种法(MIT)和细胞培养分离技术(CIT)分离狂犬病病毒,并进行TCID50和LD50测定;以RT-PCR法扩增其核蛋白(N)和糖蛋白(G)基因,克隆入T载体并测序后,下载GenBank内已有的狂犬病病毒数据资源,以(Clustal和MEGA3软件)进行基因同源性比对及系统发生分析。结果从广东、河北两省分离到狂犬病病毒街毒4株,分别命名为GN07、WJ07-1、WJ07-2、GC07;序列分析表明4株狂犬病病毒均为基因1型,其N基因与G基因核苷酸的同源性分别为89.5%~99.9%和87.9%~99.9%,其中GN07与WJ07-1、WJ07-2、GC07的同源性较低。与己知的基因1型狂犬病毒相比,WJ07-1、WJ07-2、GC07与湖南、湖北、云南、浙江等地分离株及印度尼西亚分离株核苷酸同源性最高,分别为97.8%~99.4%和92.2%;GN07与CTN疫苗株核苷酸同源性最高,为94.5%。系统发育分析表明,4株病毒与CTN疫苗株同源性较高,与人用狂犬病疫苗3aG、PV株及兽用狂犬病疫苗ERA株和Flury疫苗株的同源性相对较远。适应细胞培养后,四株街毒的LD50和TCID50最高者为GN07,而WJ07-1较低,差别较大。结论4株狂犬病分离株与我国南北方不同地区狂犬病流行毒株的基因和氨基酸序列存在一定差异,在进化关系上分属于不同的分支。     

狂犬病病毒核蛋白基因-重组犬2型腺病毒的构建研究

目的获得具有感染性的狂犬病病毒核蛋白-犬2型腺病毒,并对重组病毒生物学和免疫学特性进行初步探讨。方法对克隆的犬2型腺病毒全基因组E3区进行部分缺失后,插入由CMV启动子、狂犬病病毒SRV9株核蛋白基因和牛生长激素polyA构成的长2392bp的表达盒,然后通过AscⅠ和PvuⅠ双酶切,游离重组全基因组,转染犬肾细胞系。结果盲传5代后,细胞产生典型病变。经鉴定,确定得到了狂犬病病毒核蛋白-重组犬2型腺病毒（CAV-2-RN）。Western blot检测表明,狂犬病病毒核蛋白在重组犬2型腺病毒中得到了表达。结论重组病毒可以诱导受试犬产生针对犬2型腺病毒和狂犬病病毒核蛋白的特异性抗体。     

猫用高效狂犬病灭活疫苗研究

目的研制水包油新型佐剂狂犬病疫苗开展猫的免疫试验。方法利用BHK-21细胞培养狂犬病病毒鼬獾源性JX04-45株,病毒滴度达到10^7.5 TCID₅₀/mL以上的病毒培养物用于灭活和疫苗制备,佐剂为新型水包油型;通过本实验室建立的荧光抗体病毒中和试验(FAVN)测定疫苗效力和猫免疫后的中和抗体,并进行了攻毒试验,评价本疫苗免疫效果。结果一个剂量的疫苗免疫小鼠后FAVN方法测定的疫苗效力≥3.0 IU/剂量;水包油佐剂型狂犬病灭活疫苗免疫猫后14 d时无不良反应,FAVN测得其诱导的中和抗体水平平均达16.04±4.29 IU/mL,28 d平均达37.13±6.12 IU/mL,56 d为21.01±7.61 IU/mL。180 d为6.71±3.44 IU/mL,360 d为2.66±2.01 IU/mL。至15个月时,咬肌攻毒10⁶MIC LD₅₀狂犬病病毒BD06株,观察90 d试验组无一死亡,对照组全部死亡。结论本疫苗诱导长达1年的免疫保护,可扩大安全评价和临床试验,以验证其实用价值。     

狂犬病病毒糖/核蛋白基因疫苗和IL-18在犬的免疫试验研究

目的　检测狂犬病病毒糖 /核蛋白“二价”基因疫苗及IL - 18在犬体内的免疫效果 ,并确定不同包裹剂对基因疫苗免疫效果的影响。方法　本试验以 pIRES1neo和人用灭活苗分别作为阴、阳性对照 ,以糖 /核蛋白双基因共表达载体 pIGN单独或与IL - 18的真核表达载体pIIL18混合 ,以司苯 -甘油混合或以生理盐水溶液形式 ,按每条犬 2 0 0 μgDNA/ml,接种 3次 (其中 1组第 3次加强免疫时采用浓缩的狂犬病灭活苗 ) ,间隔 2周的免疫程序 ,经股四头肌进行注射免疫。通过间接ELISA、细胞中和试验及淋巴细胞转化试验分别检测体液和细胞免疫水平。结果与结论　结果显示 ,1.所有试验组在第 3次加强免疫后特异性抗体和中和抗体水平显著高于阴性对照组 ;pIGN pIIL18组诱导的细胞免疫水平高于无 pIIL18的 pIGN免疫组 ;2 .以司苯 -甘油作为包裹剂的基因疫苗诱导产生的免疫应答水平与裸质粒 (生理盐水溶液 )形式的基因疫苗间无显著差异 ;3.以糖 /核蛋白二价基因疫苗pIGN作为基础免疫 ,再以狂犬病浓缩灭活苗加强免疫后 ,能迅速诱导较高的体液免疫应答水平。以上结果说明 ,狂犬病病毒糖 /核蛋白“二价”DNA疫苗具有实际应用于免疫预防的潜力。     

一种改进的显微注射用DNA片段的纯化方法

目的显微注射用DNA的纯度是影响转基因动物制备成功与否的重要因素,本文建立一种可行的适用于普通实验室的纯化DNA方法,替代普遍使用的试剂盒纯化方法。方法分别使用酚-氯仿多次抽提法及常规的凝胶提取试剂盒纯化含有蚓激酶基因的DNA片段,通过显微注射技术将纯化的DNA片段导入小鼠受精卵的原核,制备转基因小鼠。根据转基因实验的结果对两种方法进行比较。结果使用两种方法纯化DNA均能获得转基因小鼠。在DNA纯度及注射卵的存活率上,两种方法无明显差别;在移植卵的出生率及转基因阳性率上,抽提法优于试剂盒法。结论本实验建立的抽提方法可以替代试剂盒方法纯化显微注射用DNA片段,在降低实验成本、简化实验条件及提高转基因阳性率方面具有优势。