群体感应调控子AphA对河弧菌Ⅵ型分泌系统VflT6SS2的调控研究

目的 研究河弧菌群体感应调控子AphA对Ⅵ型分泌系统VflT6SS2功能活性的调控机制。方法 采用Western Blot检测河弧菌野生株、aphA缺失株（ΔaphA）和aphA回补株中VflT6SS2标志性组件溶血素共调节蛋白（Hcp）的表达和分泌。采用实时荧光定量PCR和启动子-lux 融合冷光系统检测野生株和ΔaphA中VflT6SS2核心基因簇和附属基因簇代表基因tssB2、hcp（tssD2）和vgrG（tssI2）以及群体感应调控子HapR的mRNA相对表达量和启动子活性。采用定点突变实验结合启动子活性测定确定AphA在 tssD2b启动子区的调控结合位点;采用电泳迁移率位移测定（EMSA）确定AphA与hapR启动子的结合。结果 ΔaphA中tssB2、hcp（tssD2）、vgrG（tssI2）和hapR的mRNA相对表达量及Hcp蛋白的表达分泌明显高于野生株。VflT6SS2核心基因簇、tssD2a、tssI2a和hapR的启动子活性在ΔaphA中均高于野生株,而tssD2b启动子活性则低于野生株。tssD2a和tssD2b的启动子序列分析显示-335 bp~-229 bp区差异较大,在tssD2b中该区域存在2个潜在AphA结合位点,将其中的保守位点ATG替换为CGA,tssD2b启动子活性明显降低。EMSA结果显示,AphA与hapR启动子直接结合。结论 AphA在转录水平直接抑制hapR的表达,间接参与对VflT6SS2核心基因簇和附属基因簇的调控。AphA对tssD2a和tssD2b呈现相反的调控模式,AphA可直接与tssD2b启动子区（-335 bp~-229 bp）结合正向调控tssD2b的表达。     

甲型流感病毒H1N1感染致小鼠肠道损伤机制的研究

目的 观察甲型流感病毒H1N1感染小鼠的一般状态、肺组织病理、肠组织病理、结肠转录组、肠内容物代谢组的变化,探究甲型流感病毒H1N1感染致小鼠肠道损伤的机制。方法 用流感病毒PR8感染C57BL/6J小鼠,留取感染后第7天肺组织、结肠组织和盲肠内容物,计算肺指数,测量结肠长度,采用苏木素–伊红染色观察肺、肠组织病理,RNA-seq法进行结肠转录组测序,非靶向代谢组学检测盲肠内容物。结果 感染模型组小鼠较空白对照组小鼠体质量减轻、活动减少,肺指数增加,结肠长度缩短,肺、结肠组织病理出现损伤。空白对照组和感染模型组小鼠共有1 609个差异基因,437个差异代谢物,这些差异基因和差异代谢物共同富集到的通路包括花生四烯酸代谢通路和色氨酸代谢通路。结论 甲型流感病毒感染可能通过改变小鼠结肠内基因表达水平和盲肠内的代谢产物造成小鼠肠道损伤。     

河弧菌VfqI-VfqR密度感应系统对VflT6SS2附属基因簇中vgrG操纵子的调控研究

  目的  探究河弧菌VfqI-VfqR密度感应系统对VflT6SS2附属基因簇hcp-vgrG中vgrG操纵子的调控。   方法  使用荧光定量反转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测野生株和VfqI-VfqR系统缺失株中vgrG的mRNA水平。 利用启动子-lux报告质粒系统检测冷光值,确定vgrG启动子在河弧菌野生株、缺失株、回补株中的活性差异。 在大肠埃希菌中,导入VfqR过表达质粒,检测vgrG启动子-lux报告质粒冷光值,确定VfqR可否激活vgrG启动子。  结果  ?vfqI、?vfqR和?vfqI-vfqR缺失株中vgrG mRNA水平和启动子活性均显著低于野生株;在?vfqR中回补VfqR表达质粒pSRvfqR和在?vfqI中分别添加3-oxo-C₁₀-HSL、C₁₀-HSL和3-oxo-C₁₂-HSL AHLs分子均能恢复vgrG启动子活性,并且3种AHLs分子效果大体一致。 在大肠埃希菌中过表达VfqR并添加上述3种外源AHLs,对vgrG启动子活性没有影响。  结论  VfqI-VfqR密度感应系统在启动子水平正性调控vgrG操纵子,并且该调控作用是间接的。     

高危型HPV-16E6在小鼠骨髓源性树突细胞的表达

目的探讨高危型HPV-16E6在树突细胞中的定位。方法构建真核表达载体pGFP-16E6,转染小鼠骨髓源性的树突细胞,在荧光显微镜下动态观察高危型HPV-16E6蛋白在树突细胞内的定位和表达水平。结果树突细胞在分别转染pGFP-16E6和pEGFP-C1质粒后,GFP-16E6主要定位于细胞核内,而对照组的只表达GFP的蛋白则均匀分布于树突细胞。蛋白表达水平的检测表明,在转染树突细胞后的12h,GFP-16E6和GFP蛋白开始表达（荧光强度分别为31.29,39.52）,转染后至24h,蛋白表达均到达高峰（荧光强度分别为119.37,134.23）,24h后,蛋白表达逐渐降低。结论 HPV-16E6主要定位于树突细胞核内,随时间其蛋白表达水平不同,这为HPV E6的树突细胞疫苗发挥有效的抗癌作用提供理论依据。     

基于转录组测序技术分析中医三阳合治法减轻流感病毒致小鼠结肠损伤的作用机制

目的应用转录组测序技术研究麻杏石甘汤合小柴胡汤(以下称三阳合治)减轻流感病毒感染小鼠结肠损伤的作用机制。方法甲型流感病毒H1N1滴鼻诱导流感病毒致小鼠结肠损伤模型。小鼠分为空白组、模型组和三阳合治组, 每组10只小鼠。模型组、三阳合治组分别以PBS、麻杏石甘汤合小柴胡汤灌胃, 7天后取各组小鼠结肠组织, 观察结肠长度及结肠病理损伤情况, 并进行转录组测序, 筛选三阳合治组与模型组显著差异基因进行GO、KEGG和GSEA分析。结果三阳合治干预后显著改善了小鼠的结肠长度, 减轻了结肠病理损伤。三阳合治组与模型组有92个显著差异表达基因, GO分析提示差异基因富集于细胞因子和趋化因子产生的调节、炎症应答、防御反应、免疫反应、NIK/NF-κB信号的调节以及MAPK级联等生物过程, 以及刷状缘膜、刷状缘、微绒毛等与肠道屏障相关的细胞组分。KEGG分析提示差异基因富集于Toll样受体信号通路、产生IgA的肠道免疫网络、补体和凝血级联以及PPAR信号通路等。GSEA分析提示产生IgA的肠道免疫网络、PPAR信号通路以及丙酸代谢和丁酸盐代谢等在三阳合治干预后显著上调, 而凋亡和MAPK信号通路在...     

基于网络药理学和实验验证探究角药"黄芩-知母-石膏"治疗流感病毒性肺炎的机制

目的揭示角药"黄芩-知母-石膏"治疗流感病毒性肺炎可能的作用机制。方法通过传统中药系统药理学数据库和分析平台(traditional Chinese medicine systematic pharmacology, TCMSP)、中药分子机制生物信息学分析网络(Bioinformatics analysis tool for molecular mechanism of traditional Chinese medicine, BATMAN-TCM)、基因和化学物质相互作用预测数据库(search tool for interacting chemicals, STITCH)筛选黄芩、知母和石膏的活性成分并进行靶点预测, 通过人类基因数据库(GeneCards)获取流感病毒性肺炎的疾病靶点。将药物与疾病的共同靶点导入蛋白相互作用数据库(STRING)进行蛋白质相互作用(protein-protein interaction, PPI)网络分析, 利用Cytoscape 3.9.1软件构建药物-活性成分-靶点网络和核心靶点网络, 利用注释及可视化整合分析工具(database for...     

TaqMan实时荧光定量PCR检测艰难梭菌

目的 建立特异敏感的实时荧光定量PCR方法,用于艰难梭菌的快速检测;评价基于纯培养艰难梭菌和粪便中艰难梭菌的2种标准曲线;并应用该荧光定量PCR法对急性艰难梭菌感染（CDI）的小鼠进行粪便含菌量检测评价。方法 针对艰难梭菌基因组中16S rRNA序列设计特异性引物和探针,建立一套快速检测艰难梭菌含量的实时荧光定量PCR方法,验证方法的特异性、灵敏性;绘制艰难梭菌纯菌浓度梯度稀释标准曲线和粪便中同浓度梯度艰难梭菌的标准曲线,比较两者的差异;用艰难梭菌高毒株NAP1/027感染用抗生素处理的C57BL/6小鼠,建立CDI小鼠模型,同时应用该荧光定量PCR和活菌培养法定量检测小鼠粪便中的艰难梭菌含量变化。结果 建立的TaqMan实时荧光定量PCR具有较高的灵敏性和特异性,生成标准曲线的相关系数为0.999 8,斜率为-3.400 4;用纯培养艰难梭菌和粪便中艰难梭菌分别制备标准曲线,结果表明2种标准曲线定量检测结果差异无统计学意义。建立CDI小鼠模型,应用该荧光PCR能有效、准确的检测出粪便中艰难梭菌的含量,可替代费时费力的活菌培养计数法。结论 用纯培养艰难梭菌来制备标准曲线不影响对含菌粪便标本的准确定量检测,荧光定量PCR能准确快捷地检测CDI小鼠粪便中的艰难梭菌含量,比活菌计数更快速和方便,可用于艰难梭菌感染小鼠模型中小鼠肠道内艰难梭菌定植的定量检测。     

重组表达的猪溶素及其突变体诱导小鼠巨噬细胞的细胞毒性和IL-1β释放

目的观察猪溶素(Suilysin,SLY)及其无溶血活性的突变体诱导小鼠腹腔巨噬细胞(peritoneal macrophage,PM)释放IL-1β和细胞毒的差异,为进一步研究SLY诱导炎性体激活通路奠定基础。方法重组表达纯化SLY及第353氨基酸位点突变体rSLY353L,体外和小鼠PM相互作用,用乳酸脱氢酶释放法检测细胞毒作用,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测IL-1β的水平。结果不同浓度rSLY(0.1~10μg)诱导小鼠PM细胞毒性呈现明显的剂量效应,rSLY(1μg/ml)诱导产生750 pg/ml的IL-1β同时细胞毒20%;rSLY(5μg/ml)可引起最大量的IL-1β释放但细胞毒高达90%。相同剂量的rSLY353L不能诱导可检测到的IL-1β和细胞毒性。rSLY与PM共孵育20 h IL-1β产量最高,20 h后IL-1β产量下降但细胞毒性随孵育时间延长而增大。结论 1μg/ml SLY和PM作用20 h可诱导较高的IL-1β产生同时细胞毒性较低,该实验条件适用于进一步进行SLY激活PM炎性体信号通路的机制研究。     

肠出血性大肠埃希菌感染人巨噬细胞产生白介素-1β水平的研究

目的 通过构建EHEC O157:H7野生株和突变株等不同菌株,来感染THP-1细胞,从而比较以上不同菌株的细胞毒和IL-1β等细胞因子的产生水平,同时比较使用有无胎牛血清(FBS)培养的THP-1对产生细胞因子水平的影响。 方法 将上述各菌株分别定量稀释于RPMI1640,5%FBS的细胞培养液中,在感染后2~10 h,用cytotox96试剂盒定量检测乳酸脱氢酶(LDH)的释放。同时用Luminex和酶联免疫吸附试验试剂盒定量检测多种细胞因子的水平。 结果 EHEC -O157:H7-ehxA是THP-1细胞毒作用的主要贡献者,并可引起高水平IL-1β的产生;在OPT1-MEM无血清培养基中,野生型菌株和突变型之间IL-1β的产生差异则更加显著。 结论 EHEC-O157:H7-ehxA 可诱导高水平IL-1β的产生,FBS能刺激细胞产生一定非特异性的IL-1β,这可能会导致高的背景和隐藏细胞株之间的真正差别。     

耐万古霉素肠球菌小鼠感染模型的优化

目的 优化小鼠经口感染耐万古霉素肠球菌（VRE）肠道定植模型,明确不同抗生素预处理方式和感染剂量对VRE在肠道定植的影响。 方法 C57/6J小鼠随机分为3组,分别为混合抗生素、氨苄西林、万古霉素预处理组。 混合抗生素预处理组:感染前第7天给予小鼠混合抗生素（卡那霉素、庆大霉素、粘菌素、甲硝唑、万古霉素）水溶液;感染前第2天,将混合抗生素水溶液换为万古霉素水溶液,感染前1 d,腹腔注射克林霉素。 氨苄西林与克林霉素预处理组:感染前第7天给予氨苄西林水溶液,感染前1 d,腹腔注射克林霉素。 万古霉素预处理组:感染前第7天给予万古霉素水溶液。第0天,3组小鼠同时进行VRE灌胃处理。 感染后第3天,氨苄西林、万古霉素水溶液改换为正常饮用水,直至实验结束。 在感染后2周内对收取的小鼠粪便活菌计数,观察VRE定植量的变化。 结果 感染后第1天,VRE在3种抗生素预处理的小鼠肠道中均能成功定植。 在感染后1 ~ 9 d,3种模型的粪便VRE含量在105 ~ 108 cfu/mg。 感染后第9天,3组小鼠粪便中VRE定植量出现下降趋势,第15 天（实验结束）粪便VRE含量降至103 ~ 105 cfu/mg。 另外,感染后第10天氨苄西林处理组中有2只小鼠死亡。 对万古霉素预处理模型给予的2个不同感染剂量,在整个急性感染期两组VRE定植量差异无统计学意义。 结论 万古霉素预处理的VRE肠道定植模型的稳定性和简洁性优于混合抗生素或氨苄西林预处理的模型。 在万古霉素预处理模型中,VRE可在肠道定植至少15 d,且感染剂量在105 ~ 107 cfu/只间不影响VRE的肠道定植模型的建立。