刚地弓形虫ROP2-P30复合基因在E.coliBL21中的表达和鉴定(英文)

目的获得编码弓形虫RH株棒状体蛋白2和主要表面抗原1重组复合蛋白为弓形虫病快速诊断试剂盒及蛋白质疫苗的研制作准备。方法用PCR技术从弓形虫基因组DNA中扩增出ROP2和P30基因片段,分别克隆入pMD18T载体,并对重组入外源基因的质粒通过PCR.,双酶切和测序鉴定,将pMD ROP2中的ROP2基因片段经EcoRⅠ和HindⅢ酶切,连接等反应,亚克隆入pET30a(+)原核表达载体构建pET ROP2载体,然后再将pMD P30中的P30基因片段与经BglⅡandEcoRⅠ酶切的pET ROP2载体连接,构建pET ROP2P30载体,经含卡那霉素的LB平板筛选,酶切和PCR鉴定。阳性重组质粒转化到大肠埃氏菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达产物用SDS PAGE进行鉴定。大量的表达融合蛋白经纯化和复性后,用Westernblot分析。结果从弓形虫RH株基因组DNA中扩增出特异的ROP2和P30基因片段,成功构建成pET ROP2和pET ROP2P30载体,成功表达了弓形虫棒状体蛋白2和弓形虫棒状体蛋白与主要表面抗原1的融合复合蛋白,表达出的蛋白经纯化复性后具有免疫反应性。结论ROP2和P30基因重组后,在原核表达载体中表达出的蛋白经纯化复性后具有活性,获得纯化和复性的弓形虫ROP2和ROP2P30的高效表达产物,为弓形虫病的诊断和疫苗研究奠定了基础。     

不同高度、不同容器水质中蚊幼虫滋生情况观察

随着我国经济的发展,人民生活水平的提高,城市化进程的加快,我国城乡环境发生了很大变化.了解变化后的蚊虫滋生情况,对其防制具有重要意义.为此,我们在济宁市中区利用陶土缸盛装不同水质的水,放置不同高度楼层模拟滋生地,观察自然界蚊虫产卵滋生幼虫情况.     

寄生虫和宿主微(常)量元素含量分布及其与致病关系的研究

微量元素和某些金属常量元素如锌(Zn)、铁(Fe)、铜(Cu)、硒(Se)、锰(Mn)、钙(Ca)、镁(Mg)等是构成多种激素、酶和维生素的关键成分和反应催化介质,是维持机体正常代谢及生命活动的重要物质,同时这些元素能够促进机体的细胞免疫和体液免疫,刺激机体抗体或免疫球蛋白的产生,增强机体的抗病能力,与寄生虫的感染、致病有着密切的关系。现将有关微(常)量元素与寄生虫病关系的研究进展综述如下。     

弓形虫不同组分抗原免疫保护性的研究

目的　探讨弓形虫体不同组分抗原诱导的细胞免疫应答及其对宿主的免疫保护力。　方法　应用SDS PAGE电泳对弓形虫体超声粉碎抗原进行分离、纯化 ,选择特异性抗原组分进行配伍 ,然后与福氏佐剂混合免疫小鼠 ,检测多项免疫指标 ,并观察弓形虫对各免疫鼠的攻击力。　结果　SDS PAGE电泳显示 ,弓形虫体抗原有 7条特异抗原带 ,对其中 4条 (P67、P3 5、P3 0、P2 2 )分离、纯化、配伍后分别免疫小鼠 ,各实验鼠脾脏的CD8+ T淋巴细胞及其脾细胞培养液中IL 2、IFN γ的滴度均随免疫时间延长而增加 ,其中以P3 0 /3 5配伍组增高最明显 ,并且该组合诱导的免疫保护力最强 ,攻击感染后平均存活时间 (7.0 5d)明显长于其它实验组和对照组 (P <0 .0 5 )。　结论　P3 5和P3 0蛋白联合使用能诱导小鼠产生较高的细胞免疫和较强的免疫保护力 ,二者可能成为弓形虫多价亚单位疫苗的侯选抗原。     

刚地弓形虫P30(SAG1)基因的克隆与表达

目的构建弓形虫P30基因表达载体并获得重组表达蛋白。方法将弓形虫P30基因的开读框用PCR扩增,NcoⅠ和HindⅢ酶切后,与同样酶切的表达质粒pET30a(+)经T4连接酶连接,然后转化到DH5α中。菌液经PCR扩增和质粒酶切及基因测序鉴定后,将阳性重组质粒转化到大肠埃希菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达产物用SDS PAGE和Westernblot进行鉴定。结果扩增的P30基因片段为750bp,重组质粒诱导表达产物分子质量单位为30ku,与理论值相符。Westernblot确认重组质粒表达蛋白与小鼠抗弓形虫单克隆抗体(P30McAb)发生特异性反应。结论成功构建重组体并获得弓形虫主要表面抗原P30的高效表达产物,为弓形虫病的诊断和疫苗研究奠定了基础。     

结核杆菌磷酸烯醇型丙酮酸羧基酶诱导小鼠细胞和体液免疫应答

目的检测结核杆菌磷酸烯醇型丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase,PEPCK)对BALB/c小鼠的免疫保护作用。方法选清洁级BALB/c小鼠60只,随机分为两组,实验组和对照组。实验组每只小鼠用表达的PEPCK融合蛋白10μg加弗氏不完全佐剂进行腹腔免疫注射,对照组小鼠仅用弗氏不完全佐剂注射。每隔2w免疫1次,共免疫3次。末次免疫2w后,分别取小鼠脾脏、血清,流式细胞仪检测CD4+和CD8+T细胞,MTT法检测淋巴细胞对刺激的应答水平,ELISA检测血清各种细胞因子及抗PEPCK抗体。结果实验组小鼠的脾脏明显大于对照组小鼠的脾脏,且粘连严重,CD4+T细胞增殖明显(73.5±3.69),CD4+/CD8+比值显著升高(5.1±0.98)(P<0.01);且淋巴细胞的应答能力明显强于对照组小鼠;实验组小鼠血清中IFN-γ、IL-12和TNF-α明显高于对照组,血清抗体滴度随免疫次数逐步增高。结论结核杆菌PEPCK能够有效的刺激机体产生细胞免疫反应和体液免疫反应,尤以细胞免疫反应为主,是很好的抗结核候选疫苗分子之一。     

膀胱内乳糜凝块的B超表现

乳糜尿是班氏丝虫病晚期症状之一 ,重型患者尿中常伴有乳糜凝块。近年来作者应用 B超观察到 2 4例患者膀胱内有乳糜凝块 ,将其影像表现总结如下。1　资料与方法1.1　临床资料　本组 2 4例患者为门诊或住院病人 ,其中男 15例 ,女 9例。2 6～ 4 9岁 8例 ,5 0～ 70岁 16例 ,病程 2～ 4 3年。既往血检微丝蚴阳性 13例 (5 4 .2 % )。尿液乳糜鉴定全部阳性 ,尿蛋白定量 2 .0～ 6 .2 g/ L。肉眼观察 ,尿液为乳糜型 15例 ,其中混有凝块者 12例 ;乳糜血型 9例 ,其中混有凝块者 7例。2 4例患者均有尿中排出凝块史。1.2　检查方法　使用日本 Aloka- S…     

门诊肠道寄生虫病感染状况的纵向观察

本文对 1981-2 0 0 0年门诊病人肠道寄生虫感染资料进行统计分析 ,总感染率为 30.89% ( 33607/ 10 8795 ) ;其中肠道蠕虫感染占 78.14% ,肠道原虫感染占 21.86 %。主要感染虫种为蛔虫、蓝氏贾第鞭毛虫、钩虫、肠滴虫、猪带绦虫和阿米巴。 2 0年间肠道寄生虫感染率呈明显下降趋势 ,由 1981年的 46.61%下降到 2000年的 12.82 % ;但近年来肠道蠕虫感染率下降速度变缓 ,而肠道原虫感染率呈现上升趋势 ,优势虫种亦由蛔虫、钩虫为主转为蓝氏贾第鞭毛虫、蛔虫居前。虽然肠道寄生虫感染 2 0年间变化较大 ,但每年的季节分布仍未打破 ,感染率以第三季度最高 ,第一季度最低。结果表明 ,目前人体肠道寄生虫病感染率还比较高 ,尤其是肠道原虫。因此 ,仍需根据季节、虫种、人群等具体情况 ,搞好肠道寄生虫病的防治工作.     

弓形虫多基因核酸疫苗构建及其免疫保护性研究

目的 构建弓形虫多基因核酸疫苗, 评价其免疫保护性。方法 PCR扩增热休克蛋白 （HSP70） 基因片段, 克隆到 pcDNA3?ROP2?p30重组质粒中, 构建pcDNA3?ROP2?p30?HSP70多基因核酸疫苗。采用该疫苗免疫BALB/c小鼠, 检测小鼠脾淋巴细胞及全血CD4+ 、 CD8+ , 血清、 脾淋巴细胞培养液中IgG、 IgM、 IgA和IFN?γ、 TNF、 IL?2、 IL?4、 IL?12等, 并进行弓形虫攻击感染实验。结果 应用PCR扩增出916 bp HSP70基因片段, 成功构建pcDNA3?ROP2?p30?HSP70重组体, 其中包含 HSP70 蛋白基因读码框内的完整序列。该弓形虫多基因核酸疫苗能诱发小鼠产生细胞免疫和体液免疫, 实验组小鼠血清抗体滴度高, CD4+ 和 CD8+ 均增殖明显, 组间差异有统计学意义（FCD4+ =45.00, FCD8+ =15.01, P均＜0.01）; 其血清及脾细胞培养液中IFN?γ、 IL?2和IL?12含量均明显升高, 尤以血清中升高显著。攻击实验结果显示, 实验组小鼠存活时间明显延长。结论 pcDNA3?ROP2?p30?HSP70多基因核酸疫苗具有较强的免疫原性, 能产生较好的免疫保护作用。     

班氏丝虫特异生物素DNA探针的制备及用于丝虫基因检测的研究

为寻找一种敏感、特异的丝虫病监测方法,根据班氏丝虫ｐ Ｗ ｂ１２ 重复序列,用聚合酶链反应扩增班氏丝虫特异的 Ｄ Ｎ Ａ 片段（４９０ ｂｐ）,回收后用光敏生物素标记该片段,制备成非放射性 Ｄ Ｎ Ａ 探针,并在探针的制备方法上做了新的尝试。实验结果显示,该探针只与班氏微丝蚴及其感染蚊 Ｄ Ｎ Ａ 出现杂交,与马来微丝蚴、正常蚊以及人白细胞的 Ｄ Ｎ Ａ 未出现杂交;检测 ６ 份现场镜检班氏微丝蚴阳性的血样 Ｐ Ｃ Ｒ 产物全部阳性,８ 份正常对照均阴性;与微丝蚴模拟血样本和 Ｄ Ｎ Ａ 样本的 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增产物杂交时,敏感性分别达１ 条微丝蚴／１００ μｌ和 ２ ｐｇ;检测人工感染的班氏丝虫阳性蚊虫扩增产物全部阳性,正常蚊全部阴性。