刚地弓形虫MIC8 CTD作用蛋白的筛选及鉴定

目的从刚地弓形虫速殖子裂解液中筛选并鉴定微线体蛋白8羧基端胞质尾(MIC8CTD)的作用蛋白。方法分别以GST-MIC8CTD蛋白和GST蛋白(对照)作为探针蛋白,采用GST pull-down技术从弓形虫裂解液中筛选目标蛋白并进行SDS-PAGE分析;将目标蛋白转印至PVDF膜,测序,通过BLAST2在线对比搜索相似蛋白序列,初步确定目标蛋白;以目标蛋白抗体为一抗进行Western blot,分析GST pull-down产物与目标蛋白抗体的相互作用;分别用GSTMIC8CTD多克隆抗体和兔免疫前血清结合的sepharose与弓形虫裂解液进行免疫共沉淀试验,沉淀物进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果 PAGE显示GST-MIC8CTD蛋白的pull-down产物中有一蛋白条带(分子质量单位约35~45ku),GST蛋白的pull-down产物中无此蛋白;BLAST2比对目标蛋白的氨基酸序列与弓形虫醛缩酶序列一致;ECM检测GST-MIC8CTD多克隆抗体的免疫共沉淀产物中有蛋白组分可被相应的抗体识别,免疫前血清的免疫共沉淀产物中无可被识别的蛋白。结论经GST pull-down技术和免疫共沉淀试验筛选、鉴定,弓形虫MIC8CTD的作用蛋白为醛缩酶。     

刚地弓形虫MIC2与醛缩酶作用位点的鉴定

目的 确定刚地弓形虫微线体蛋白2(MIC2)与醛缩酶的作用位点。方法 利用定点突变技术,将MIC2羧基端(MIC2C)的767位色氨酸(W⁷⁶⁷)突变为丙氨酸(A)。PCR扩增MIC2C W/A突变体基因片段;构建MIC2C W/A/pGEX-4T-1重组原核表达系统,IPTG诱导表达GST-MIC2C W/A突变体蛋白。分别以该蛋白和GST-MIC2C蛋白(对照蛋白)作为探针蛋白与弓形虫速殖子裂解液进行GST pull-down实验,SDS-PAGE及Western blot分析。结果 获得了MIC2C W/A突变体基因片段,制备了GST-MIC2C W/A突变体蛋白; GST-MIC2C蛋白的pull-down产物中有一蛋白条带,而且可以被醛缩酶抗体识别,而GST-MIC2C W/A蛋白的pull-down产物中未见蛋白条带。结论 将MIC2的W⁷⁶⁷突变为A后,MIC2失去与醛缩酶的作用,即MIC2与醛缩酶的作用位点为色氨酸(W)。     

弓形虫肌动蛋白表达及其抗血清制备

目的体外制备弓形虫肌动蛋白(actin)及其多克隆抗体。方法以弓形虫cDNA链为模板,PCR扩增actin基因,亚克隆至pET30a载体,转化到大肠埃希菌BL21中;异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达actin-His₆蛋白;用纯化的蛋白加免疫佐剂免疫SD大鼠,收集抗血清,制备多克隆抗体,抗体亲和纯化柱纯化并分析抗体的效价。结果actin基因的PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳,结果显示,在1 000 bp附近有一条带,与目的基因(actin cDNA长度为1 131 bp)大小相符;actin/pET30a重组质粒经BamHI和XhoI双酶切, 1.0%琼脂糖凝胶电泳分析酶切产物,在1 000和5 000 bp附近可见条带;actin-His₆蛋白在3~4 h时表达量达到峰值;蛋白可溶性分析显示,actin-His₆蛋白主要以包涵体的形式存在;获得了抗actin-His₆蛋白的大鼠源性抗血清。结论弓形虫actin蛋白在原核系统中得到了表达,用该蛋白免疫动物后获得了抗血清。     

三七皂苷Rg1对脑缺血后大脑皮质和海马BDNF蛋白的影响

目的探讨三七皂苷Rg1对脑缺血后皮质和海马脑源性神经营养因子（BDNF）蛋白的影响。方法取60只成年雄性SD大鼠建立大脑中动脉缺血模型,2h后进行缺血再灌注并随机分为1、2、3、4、5组各12只,分别给予生理盐水5mg／kg、尼莫地平15mg／kg及三七皂苷Rg150、100、200mg／kg腹腔注射,于第1、3天用4％多聚甲醛饱和苦味酸进行心脏灌注并处死动物,制作脑组织冰冻切片,采用兔抗BDNF（1：500）抗体进行免疫组化ABC法染色,观察各组不同时间大脑皮质和海马BDNF蛋白灰度值及阳性神经元数量。结果大鼠大脑皮质和海马均可见BDNF蛋白阳性表达;3～5组BDNF蛋白的灰度值低于1、2组（P〈0．05、〈0．01）,阳性神经元数量显著高于1、2组（P〈0．05、〈0．01）;3、4组大脑皮质BDNF灰度值和阳性神经元数目均低于海马（P〈0．05、〈0．01）。结论三七皂苷Rg1能增加大脑皮质和海马BDNF阳性神经元的数量和蛋白含量,两部位的观察指标有显著性差异。其机制可能是BDNF不仅存在于阳性神经元中,亦可能是不同部位脑组织对药物和脑缺血的反应性不同。     

垂体腺苷环化酶激活肽对缺血再灌注脑神经元凋亡的作用

目的:观察垂体腺苷环化酶激活肽(pituitaryadenylatecyclase-activatingpolypeptide,PACAP)对缺血再灌注脑神经元凋亡的防治作用。方法:利用四血管结扎法,建立老龄大鼠脑缺血再灌注模型,侧脑室注射PACAP,观察脑组织丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧物酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性,计数海马CA1区存活和凋亡神经元数目,电镜观察神经元的超微结构变化。结果:PACAP治疗后脑组织MDA含量为(1.35±0.39)nmol/mg,SOD和GSH-Px活性分别为(115±20)NU/mg、(10.3±2.0)U/mg,与缺血再灌注组有明显差异(P<0.05),海马CA1区存活和凋亡神经元数目为48.8±4.3,14.3±2.9,能促进神经元存活和减轻凋亡损伤(P<0.01),保护超微结构。结论:PACAP的保护作用可能与其降低脑组织氧自由基水平,提高抗氧化酶活性,防止神经元凋亡有关。     

脑组织切片免疫组化技术中漂片法与贴片法效果比较

目的探讨脑组织切片免疫组化技术中漂片法与贴片法的效果。方法建立大鼠大脑中动脉缺血模型,脑组织冰冻切片,采用兔抗BDNF(1∶500)抗体,同时运用漂片法和贴片法进行免疫组化ABC法染色。结果漂片法阳性神经元数目和灰度值与贴片法比较有显著性差异(P<0.05,P<0.01)。结论脑组织切片免疫组化技术采用漂片法效果更为可靠。     

α-硫辛酸对缺血再灌注脑神经元凋亡的作用

近来研究认为,氧应激与脑缺血再灌注神经元凋亡损伤有密切关系。α-硫辛酸（ALA）是已知抗氧化剂中最强的一种,在改善人的体质、抗氧化、糖代谢、糖尿病并发症和其他多种疾病治疗方面备受关注。但ALA作为还原剂或自由基清除剂对抗脑缺血神经元凋亡和抗氧化作用较少报道。我们在老龄大鼠全脑缺血再灌注模型上观察了ALA对缺血脑组织超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱苷肽过氧化物酶（GSH-Px）以及丙二醛（MDA）水平的影响及对海马CA1区存活和凋亡神经元的影响,     

弓形虫MIC6羧基端相互作用蛋白的筛选

目的筛选与弓形虫微线体蛋白6羧基端（MIC6C）相互作用的蛋白。方法以GST-MIC6C蛋白作为探针蛋白,利用GST pull-down技术,从弓形虫裂解液中筛选与其相互作用的蛋白,SDS-PAGE分析实验产物;将目标蛋白条带转印至PVDF膜,测蛋白序列,BLAST2在线对比搜索相似蛋白序列,初步确定目标蛋白。制备目标蛋白的抗体,Western blot分析GST pull-down实验产物。结果 GST pull-down实验筛选到的目标蛋白的序列与弓形虫醛缩酶的序列一致;制备了醛缩酶的多克隆抗体,目标蛋白条带能被该抗体特异地识别。结论采用GST pull-down技术,初步筛选出与弓形虫MIC6C相互作用的蛋白为醛缩酶。     

老年大鼠全脑缺血再灌注所致神经元凋亡及氧化损伤的机制

目的　观察老年大鼠全脑缺血再灌注后神经元凋亡的规律 ,并探讨氧化损伤的机制。方法　利用四血管结扎法 ,建立老年大鼠全脑缺血再灌注模型 ,分别于缺血再灌注后 6h、1、3、5、7d计数海马锥体神经元存活数 ,原位末端标记法计数凋亡神经元数 ,电镜观察超微结构变化 ,并测定脑组织丙二醛 (MDA)含量和超氧化物歧化酶 (SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH Px)活性。结果　老年大鼠全脑缺血再灌注后海马CA1区神经元凋亡损伤在再灌注后第 3天损伤最重 ,存活神经元数显著减少 ,电镜显示有凋亡改变。脑组织SOD和GSH Px活性降低 ,MDA含量升高 ,再灌注后 3d最为明显。结论　全脑缺血再灌注神经元凋亡损伤与氧自由基水平升高 ,抗氧化酶活性降低有关。