听觉皮质-丘脑兴奋性突触传递的盲法膜片钳研究

目的:制备包含大鼠听皮质与内侧膝状体及两者间功能联系的脑片,采用盲法膜片钳全细胞记录技术,对听皮质-内侧膝状体兴奋性突触传递的生理和药理学特性进行实验观察。方法:实验于2004-04/06在第三军医大学基础部生理学教研室完成。实验动物选择出生后7～15d健康SD大鼠21只,制备与水平方向呈15°的600μm的内侧膝状体脑片,采用膜片钳全细胞记录。电极内液成分及其浓度(mmol/L)为:甲磺酸铯120、氯化镁2、羟乙基哌嗪乙磺酸10、乙二醇双(2-氨基乙醚)四乙酸0.5、三磷酸腺苷2、QX-3142;灌流液中常规加入γ-氨基丁酸A受体拮抗剂荷包牡丹碱(10μmol/L)。获得内侧膝状体神经元全细胞模式后,在电流钳或电压钳模式下,双极钨丝刺激听皮质颗粒下层(Ⅴ～Ⅵ层),给予时程为100μs的方波刺激,在内侧膝状体分离记录兴奋性突触后电位和兴奋性突触后电流;观察N-甲基-D-天冬氨酸受体阻断剂D,L-2-氨基-5磷酸基戊酸(50μmol/L)和α-氨基羟甲基恶唑丙酸受体拮抗剂氰基-2-硝基喹啉-2,3-二酮(20μmol/L)对兴奋性突触后电流的影响。结果:①观察15例内侧膝状体神经元对皮层刺激的反应,其平均膜静息电位为(49±13.5)mV,膜输入阻抗为(432±109)MΩ。电流钳模式下,刺激听皮质,可在80%(12/15)的内侧膝状体神经元记录到兴奋性突触后电位,其幅度与刺激强度在一定范围内呈正相关,在3例记录中采用了不含QX-314的电极内液,可以观察到当刺激达到阈值水平,在兴奋性突触后电位的波峰上爆发了动作电位。②选择电压钳模式;电压钳下,刺激听皮质后可在内侧膝状体神经元记录到兴奋性突触后电流,钳制电位为-70mV时,电流是内向的,加入氰基-2-硝基喹啉-2,3-二酮后,兴奋性突触后电流的幅度显著下降,进一步加入D,L-2-氨基-5磷酸基戊酸后,兴奋性突触后电流几乎完全消失。结论:600μm的旁水平位脑片包含了内侧膝状体与听皮质以及两者之间的功能性纤维联系;刺激听皮质,可在内侧膝状体记录到兴奋性突触后电位和兴奋性突触后电流;兴奋性突触后电流可以被D,L-2-氨基-5磷酸基戊酸和氰基-2-硝基喹啉-2,3-二酮所阻断。听皮质-内侧膝状体突触的兴奋性传递以谷氨酸为神经递质,主要由α-氨基羟甲基恶唑丙酸和N-甲基-D-天冬氨酸受体两种受体介导。     

心房颤动患者心房肌钾电流的研究

目的:研究心房颤动患者心房肌内向整流钾电流和乙酰胆碱敏感钾电流的变化,探讨两种离子通道电流变化在心房颤动发生与维持中的作用。方法:应用膜片钳全细胞技术记录并比较19例风湿性心脏病心房颤动患者(心房颤动组)和18例风湿性心脏病窦性心律患者(窦性心律组)心房肌内向整流钾电流和乙酰胆碱敏感钾电流密度的大小。结果:在-60mV～-120mV时,与窦性心律组相比,心房颤动组内向整流钾电流密度绝对值增大,乙酰胆碱敏感钾电流密度绝对值降低。其中在-100mV时,内向整流钾电流密度从窦性心律组的(4.01±1.01)pA/pF(n=18)增大到心房颤动组的(8.94±1.26)pA/pF(n=19,P<0.001);乙酰胆碱敏感钾电流密度从窦性心律组的(24.57±0.77)pA/pF(n=18)降低为心房颤动组的(13.38±1.03)pA/pF(n=19,P<0.001)。结论:心房颤动时,内向整流钾电流密度绝对值增大,乙酰胆碱敏感钾电流密度绝对值降低,两种电流的改变可能与心房颤动的发生和维持有关。     

小鼠pdx-1基因真核表达载体的构建及其在胚胎干细胞中的表达

目的： 克隆小鼠pdx-1基因，构建其真核表达载体，并在小鼠胚胎干细胞中表达，为糖尿病的细胞移植治疗奠定基础。方法： PCR扩增小鼠胰腺pdx-1基因 cDNA，酶切后和携带绿色荧光蛋白报告基因的真核表达载体pEGFP-N1重组，将pdx-1基因 cDNA片段连接到pEGFP-N1载体的多克隆位点，形成重组载体pEGFP/pdx-1，转化大肠杆菌DH5α菌株，构建成pdx-1基因真核表达载体质粒。扩增DH5α后抽提质粒DNA，Hind Ⅲ 和BamHⅠ酶切，电泳，DNA测序鉴定。鉴定正确的质粒DNA用脂质体包裹后转染小鼠胚胎干细胞MESPU13。结果： 从小鼠胰腺cDNA扩增出876 bp的DNA片段并成功重组到pEGFP-N1载体中。经酶切和DNA测序验证，插入载体的DNA片段为pdx-1基因，插入方向正确。重组质粒经脂质体转染胚胎干细胞MESPU13，24 h 后观察到绿色荧光蛋白报告基因和目的基因的pdx-1表达。结论： 小鼠pdx-1基因的克隆和真核表达载体构建获得成功，为进一步研究其功能奠定了基础。     

DeBDE对学习记忆能力及BDNF基因表达的影响

目的研究十溴联苯醚（decabromod iphenylether,DeBDE）暴露对雄性大鼠学习记忆能力及海马组织中BDNF基因表达的影响。方法雄性SD初断乳大鼠经口灌胃给予不同剂量100,300,500 mg/（kg.d）的DeBDE染毒,对照组给予溶剂玉米油。60 d后用Morris水迷宫测试其学习记忆能力,并用定量PCR检测其大脑海马组织中脑源性神经生长因子的表达。结果高、中剂量组大鼠空间学习、记忆能力较对照组明显降低,差异有统计学意义;低剂量组大鼠学习记忆能力与对照组比较,差异无统计学意义;高、中、低剂量组大鼠海马组织中BDNF基因的表达都显著降低,且随染毒剂量增加表达有逐渐下降的趋势。结论 DeBDE可以损害大鼠的学习记忆能力,可能和降低海马BDNF的表达有关。     

白血病相关抑制物对CFU－GM增殖的抑制作用

用半固体双层琼脂培养法，将白血病细胞植入底层，正常ＣＦＵ－ＧＭ植入上层，作白血病细胞与正常ＣＦＵ－ＧＭ的共同培养。结果发现，底层琼脂中加入０．５×１０５／ｍｌ的白血病细胞后，上层琼脂中的ＣＦＵ－ＧＭ从对照组的１９３．５下降至１２３．１／１×１０５个骨髓有核细胞（ＢＭＮＣ），加入底层的白血病细胞增加时，ＣＦＵ－ＧＭ生成进行性受抑制，当植入的白血病细胞数达１５×１０５／ｍｌ时，几乎无ＣＦＵ－ＧＭ生成。此抑制作用亦见于白血病细胞的培养上清液中。量－效关系测定发现，正常ＣＦＵ－ＧＭ培养体系中加入１０％的白血病细胞培养上清液时，ＣＦＵ－ＧＭ生成率从对照纪的１１２．２下降到８８．６／１×１０５ＢＭＮＣ，以后抑制效应不再增加。以上结果揭示，白血病细胞对ＣＦＵ－ＧＭ的抑制是经某种体液因子实现的。     

胚胎干细胞来源的巢蛋白阳性细胞向胰岛素分泌细胞分化的实验研究

目的探讨胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞分化的诱导，为糖尿病患者实施细胞移植治疗建立基础。方法将胚胎干细胞（ESC）在成纤维细胞（MEF）饲养层上扩增后脱离饲养层，让ESC自发分化成拟胚体（EB），再将EB诱导为巢蛋白（nestin）阳性的神经前体细胞（NPC），最后将NPC诱导成胰岛素分泌细胞（IPC）。结果ESC在MEF饲养层上扩增4d后，在悬浮培养状态下自发分化为EB。将EB在NPC选择性培养基中做贴壁培养后，ESC先分化为上皮样细胞，再分化为神经细胞样细胞。经过nestin免疫组化检测，在经过NPC培养基诱导4d的细胞，nestin阳性细胞占86．5％。nestin阳性细胞在IPC选择性培养基中诱导5～6d后，可分化成胰岛素分泌细胞。结论ESC来源的nestin阳性细胞既可以分化为NPC，也可以分化为IPC。     

无血清培养法诱导小鼠胚胎干细胞分化为胰岛素分泌细胞的实验条件优化选择

目的:胚胎干细胞能够在体外被定向地诱导分化为胰岛素分泌细胞的影响因素多,诱导过程复杂,诱导时间长,所得细胞数量少、功能低。通过对培养条件进行优化选择,是否可增加胚胎干细胞向胰岛素分泌细胞定向分化的可控性,以便在短时间内得到数量更多、功能更强、可用于糖尿病治疗的胰岛素分泌细胞。方法:实验于2004-03/2004-10在解放军第三军医大学基础部生理学教研室完成。①小鼠胚胎成纤维细胞饲养层细胞的制备:孕13d的胎鼠制备成纤维细胞,37℃培养。当成纤维细胞生长完全融合后,用丝裂酶素处理后备用。②胚胎干细胞的培养及扩增:胚胎干细胞接种于小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上,培养于含白血病抑制因子和胎牛血清的Dulbecco改良的Eagle高糖培养基中,37℃培养四五天。③胚胎体向神经前体细胞分化的诱导:扩增培养四五天的胚胎干细胞用胰蛋白酶消化后,于不含白血病抑制因子的培养基中悬浮培养4d,形成胚胎体。收集胚胎体后接种于无血清的选择性培养基,贴壁培养四五天后,细胞分化为神经前体细胞。④神经前体细胞向胰岛素分泌细胞分化的诱导:神经前体细胞用胰岛素分泌细胞无血清选择性培养基培养4d,再用葡萄糖刺激,神经前体细胞分化为胰岛素分泌细胞。⑤不同分化阶段的细胞检测:用形态学观察、免疫组织化学染色、碱性磷酸酶染色、双硫腙染色等方法。结果:①胚胎干细胞经四五天的培养扩增后,可形成细胞致密、形态饱满、折光度高、边界限清楚的典型胚胎干细胞集落,集落呈碱性磷酸酶染色阳性,饲养层细胞不着色。②胚胎干细胞脱离饲养层后,在不含白血病抑制因子的培养基中悬浮培养四五天,可形成球形的胚胎体。胚胎体在无血清神经前体细胞选择性培养基中贴壁培养四五天后,存活细胞85%以上分化为巢蛋白阳性的神经前体细胞。③改用胰岛素分泌细胞无血清选择性培养基培养后,多突起的神经前体细胞逐步变圆,成为细小的圆形细胞。圆形细胞逐步聚集成集簇状,经葡萄糖刺激后,这些细胞最终分化为具有胰岛素分泌细胞特征的双硫腙染色阳性细胞。结论:用无血清培养法将小鼠胚胎干细胞诱导分化为胰岛素分泌细胞,增加了实验因素的可控性,使其中最关键的神经前体细胞的比例达到85%以上,整个诱导过程仅需12～15d,增加了胚胎干细胞用于糖尿病治疗的临床运用可行性。     

纯白族家系血红蛋白H病首例报道

1临床资料回．l～般资料患儿女,白族,3．25岁。因皮肤粘膜黄染,解浓茶色尿伴低热、恶心、呕吐4无人院。既往无类似病史。体查：中度贫血貌,皮肤粘膜,巩膜中度黄染,体貌、骨骼无特殊改变。肝右肋下3．0cm,脾左助下约3．5cm。尿BIL（＋）。TBIL588μmol／I,,DBIL2454pmol·s-1／L,IBIL342．6μmol／L,AI,T11．14Pmol／L,AST72Pmol·s－‘／L,A／G2．0,抗HAV－IgM（＋）,抗HCV（－）,乙肝两对半结果无异常。1．2血液学检查RBC296X10‘’／L,WBC72X10’／L,Hb679／L,HCt18．5％,MCV62fi,MCH22．S…     

白血病患者TGF-β1及其受体表达的意义

目的：探讨白血病患者TGF-β1,及其受体表达在白血病发展过程中的意义。方法：用免疫组织化学或ELISA法检测白血病患者不同病程时期外周血、骨髓以及骨髓基质细胞的结合型TGF-β1,TGFRⅡ和可溶性TGF-β1。结果：初诊患者外周血结合型TGFRⅡ和可溶性TGF-β1含量明显下降,缓解后又升高至接近正常,结合型TGF-β1表达无明显异常。骨髓有核细胞的结合型TGFRⅡ表达情况与外周血基本一致,初诊患者明显下降,缓解后又升高。初诊患者的骨髓基质细胞生长不良,结合型和可溶性TGF-β1含量均明显低下,缓解后又趋于升高,但骨髓基质细胞TGFRⅡ未见明显异常。结论：白血病骨髓基质细胞的TGF-β1表达低下,可能是其外周血和骨髓中TGF—p,含量下降的重要原因,而白血病患者TGF-β1下降及TGFRll表达低下,可能是白血病细胞得以大量增生的重要原因。     

PS1/APP双转基因AD模型小鼠与Aβ1-40海马注射AD模型大鼠的组织病理学比较

目的 对PS1/APP双转基因阿尔茨海默病(alzheimer disease, AD)模型小鼠进行基因鉴定和组织学分析,探讨其与老化态Aβ1-40单侧海马注射AD模型大鼠之间的组织病理学差异.方法 对Tg小鼠和AD大鼠模型应用改进刚果红染色法、Nissl's染色结合免疫组织化学方法观察脑内Aβ沉积和星形胶质细胞的活化情况.结果 ①PS1/APP双转基因AD小鼠刚果红染色显示皮质和海马内广泛圆形Aβ沉积,周围绕以胶质细胞带,免疫组化显示GFAP阳性细胞活化呈团块聚集.②AD大鼠刚果红染色显示单侧海马齿回区有Aβ斑块状沉积,Nissl's染色显示注射针道附近海马锥体层细胞丢失,注射侧海马GFAP阳性细胞增多.结论 Aβ1-40单侧海马注射AD模型大鼠尽管可以模拟人类AD疾病的部分特征病理改变,但是不能模拟疾病渐进性的病理学改变.PS1/APP双转基因小鼠能够模拟AD病人脑内的主要病理改变与渐进性过程,是较为理想的实验动物模型,但该模型未发现细胞丢失.