转录因子Twist的siRNA筛选、腺病毒构建及功能检测

目的 筛选特异性沉默人的Twist基因的siRNA序列,构建siTwist腺病毒并在MG63及143B骨肉瘤细胞中进行功能鉴定.方法 体外退火获得4组siTwist双链DNA序列,克隆至含有Twist基因的pSOS-Twist质粒中获得pSOS-siTwist质粒,脂质体转染HEK293细胞,GFP检测筛选有功能的siTwist片段,将筛选出的siTwist序列构建腺病毒,感染143B骨肉瘤细胞.通过RT-PCR、Western 印迹检测Twist的表达.siTwist与Twist腺病毒共感染MG63骨肉瘤细胞,细胞计数及细胞侵袭实验检测siTwist对Twist的抑制作用.结果 在HEK293细胞中,4组siTwist中有2组GFP的表达明显降低,且siTwist腺病毒能抑制143B骨肉瘤细胞中内源性的Twist表达,Twist腺病毒能促进MG63骨肉瘤细胞的增殖和转移,而两组siTwist与Twist共感染组MG63细胞的增殖及迁徙率均明显低于Twist组(P<0.05).结论 筛选出两对特异性沉默Twist基因的siRNA片段,并成功构建腺病毒,转染细胞后能有效抑制内源性和外源性的Twist表达,为研究Twist在骨肉瘤细胞增殖和转移中的作用及具体机制提供了有效的分子工具.     

稳定表达ALB启动子及荧光素酶报告基因的肝干细胞株的构建

目的 构建稳定表达ALB启动子及荧光素酶报告基因的肝干细胞株.方法 PCR扩增获得ALB启动子,并与pBGLuc连接获得携带ALB启动子及荧光素酶报告基因的pBGLuc-ALB质粒,脂质体转染质粒到不同细胞,ALB-GLuc活性检测功能.构建逆转录病毒,感染HP14.5肝干细胞株获得携带ALB启动子及荧光素酶报告基因的稳定细胞株,经Dex、HGF体外诱导后第3、6、9、12天ALB-GLuc检测荧光素酶活性,免疫荧光检测ALB的表达.结果 PCR、酶切及测序结果显示ALB启动子正确插入至荧光素酶GLuc基因上游,HEK293、HP14.5、LC14d及Hepa1-6细胞中ALB-GLuc活性与免疫荧光结果一致.HP14.5 ALB-Gluc稳定细胞株在高浓度的稻瘟菌素中存活,免疫荧光结果显示Dex、HGF诱导后细胞中ALB的表达逐渐增强,并与ALB-Gluc活性升高一致.结论 成功构建了稳定表达ALB启动子及荧光素酶报告基因的肝干细胞株,为研究肝干细胞的体外成熟分化提供了重要的细胞手段.     

重组siRARγ腺病毒构建及其对小鼠肝脏祖细胞分化的影响

目的构建并筛选小鼠RARγ基因的siRNA腺病毒载体,并探讨抑制RARγ表达对小鼠肝脏祖细胞分化的影响。方法设计3对特异性针对小鼠RARγ基因的siRNA序列,体外退火形成双链,与SfiⅠ酶切后的pSES-HUS质粒连接,随后在BJ5183中与pAdEasy-1骨架质粒同源重组获得pAd-siRARγ重组腺病毒质粒,并在HEK293细胞中包装腺病毒Ad-siRARγ。腺病毒感染小鼠肝脏祖细胞HP14.5d,real-time PCR及Western blot检测RARγ的表达,1μmol/L ATRA诱导肝细胞分化,ALB-Gluc活性及PAS染色检测肝脏细胞分化的状态。结果 PCR、酶切鉴定均证实siRNA正确克隆至腺病毒质粒中,测序结果与设计的siRNA序列一致。腺病毒在HEK293细胞中包装10 d可见红色荧光细胞的云雾状扩增,HP14.5d细胞的48 h腺病毒感染率为60%。其中,Ad-siRARγ2、3可有效抑制小鼠HP14.5d细胞中RARγ的表达(P0.05)。ATRA可诱导肝细胞分化,ALB-Gluc活性及PAS染色阳性细胞明显高于对照组,Ad-siRARγ2,3可显著抑制ATRA诱导的小鼠HP14.5d细胞的ALB表达和糖原合成能力(P0.05)。结论成功构建并筛选出能有效抑制RARγ表达的siRNA腺病毒,感染小鼠肝脏祖细胞HP14.5d能显著抑制ATRA诱导的肝细胞成熟分化。     

携带双自杀基因且可诱导敲除SV40T的逆转录病毒载体的构建与结构鉴定

目的构建携带双自杀基因且可诱导敲除SV40T的逆转录病毒载体,优化目前的肝细胞永生化。方法去除eGFP终止子taa的pSEB-HUS质粒为逆转录病毒基础质粒。先将SV40T及其启动子hEFH亚克隆至pSEB-HUS,再将LoxP位点插入至pSEB-SV40T质粒的抗性基因Blasticidin上游获得pSEB-LoxP-SV40T质粒。同时将CD自杀基因定向克隆至pSEB-HUS的eGFP下游;然后设计一段HSV-tk自杀基因引物,在上游引物的5′端加入方向一致的LoxP序列。PCR获得TK基因后,定向克隆至CD下游获得pSEB-CD-TK,最后将pSEB-CD-TK上的双自杀基因亚克隆至pSEB-LoxP-SV40T质粒上得到携带双自杀基因及SV40T的质粒。结果PCR及酶切鉴定均证实两个自杀基因及SV40T正确克隆至逆转录病毒质粒中,目的基因序列与GenBank报道一致,两个LoxP位点方向相同。结论成功构建携带双自杀基因且可诱导敲除SV40T的逆转录病毒载体。     

稳定表达HBx的HepG2细胞对罗格列酮敏感性的影响及其机制研究

目的：构建稳定表达x基因编码的乙型肝炎病毒x蛋白（x protein of hepatitis B virus，HBx）的HepG2细胞，检测其对罗格列酮敏感性的变化，并探讨HBx与过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferators activated receptor γ，PPARγ）之间的相互作用在原发性肝癌形成过程中的可能机制。方法：构建plRES2-HBx真核表达质粒，筛选稳定表达HBx的HepG2细胞；MTT法检测细胞对罗格列酮的敏感性；免疫细胞化学法检测PPARγ定位的变化；RT—PCR和Western印迹法检测PPART的表达。结果：成功构建pIRES2-HBx真核表达质粒，获得稳定表达HBx的HepG2细胞；罗格列酮对该细胞的抑制作用明显降低（P〈0．05），经丝裂原活化蛋白激酶／细胞外信号调节激酶的激酶1（mitogen-activated protein kinase／extra-cellular signalregulated kinase kinase 1，MEK1）抑制剂PD98059预处理后，抑制率有所回升；PPARγ表达量变化的差异无统计学意义，但在细胞中的表达位置发生改变，即从细胞核转至细胞质。结论：HBx可降低HepG2细胞对罗格列酮的敏感性，可能的机制是HBx可改变PPARγ在细胞内的定位以及与DNA的结合能力．并通过磷酸化狳径影响PPARγ与配体的结合能力及其活性。     

临床及影像学评价硬化治疗静脉畸形效果研究进展

静脉畸形（VM）为最常见先天性脉管畸形,其临床表现取决于病灶范围及位置,包括疼痛、肿胀、活动受限及出血等;治疗VM方法包括硬化治疗、手术治疗及激光治疗等,硬化为一线治疗方案。目前对于评价硬化治疗VM效果尚未建立统一标准。本文围绕临床及影像学评价硬化治疗静脉畸形效果进展进行综述。     

奥美拉唑联合不同益生菌调节肠道菌群减轻小儿功能性消化不良

目的 探讨奥美拉唑联合不同益生菌调节肠道菌群减轻小儿功能性消化不良(FD)的作用。方法 选取佛山市妇幼保健院儿科2022年1月至2023年2月收治的200例FD患儿为研究对象,随机分为奥美拉唑组,奥美拉唑分别联合布拉氏酵母菌散组、酪酸梭菌二联活菌组和双歧杆菌四联活菌片组。治疗2周,对比各组患儿血清炎性因子、胃肠激素、肠道菌群、症状评分等指标变化。统计各组临床疗效及治疗期间不良反应发生率。结果 治疗后各组血清IL-6、TNF-α、IL-1β、超敏C反应蛋白(hs-CRP)、血管活性肠肽(VIP)、生长抑素(SS)水平、肠杆菌、肠球菌较治疗前显著下降(P<0.05),3个联合治疗组显著低于奥美拉唑组(P<0.05);治疗后各组血清胃动素(MOT)水平、双歧杆菌、乳杆菌显著升高(P<0.05),3个联合治疗组显著高于奥美拉唑组(P<0.05);治疗后各组症状评分较治疗前显著降低(P<0.05),3个联合治疗组显著低于奥美拉唑组(P<0.05);各组治疗期间不良反应发生率比较差异无统计学意义。结论 奥美拉唑联合不同益生菌在治疗小儿FD中均取得良好效果。     

骨形成发生蛋白9的siRNA筛选及功能检测

目的 筛选特异性沉默小鼠BMP9基因的siRNA序列,在BNLCL.2胚胎肝细胞及C3H10细胞进行功能鉴定.方法 体外退火获得4组simBMP9双链DNA序列,克隆至含有BMP9靶基因的pSOS-BMP9质粒中获得pSOS-simBMP9质粒,脂质体转染HEK293细胞,GFP检测筛选有功能的simBMP9片段,将筛选出的simBMP9构建腺病毒,感染BNLCL.2胚胎肝细胞,通过RT-PCR,Western blotting检测BMP9的表达,simBMP9与BMP9腺病毒共感染C3H10细胞, 碱性磷酸酶活性检测simBMP9对BMP9成骨诱导的抑制作用.结果 在HEK293细胞中,四组simBMP9中有两组的GFP表达明显降低,同时,腺病毒介导的这两对simBMP9均能抑制胚胎肝细胞中内源性的BMP9表达,抑制率为50%～70%,BMP9能诱导C3H10细胞的成骨分化,碱性磷酸酶的活性明显高于对照组(P<0.01),而两组simBMP9与BMP9共感染组C3H10细胞的ALP活性均明显的低于BMP9组(P<0.01).结论 成功筛选出两对特异性沉默BMP9基因的siRNA片段,能有效抑制内源性和外源性的BMP9表达,为研究BMP9在肝细胞成熟分化中的作用及具体机制提供重要的分子手段.     

新生儿阑尾炎致病菌药敏及抗菌治疗分析

目的:分析新生儿阑尾炎病原学构成、耐药性变化,为抗菌药物选择提供依据。方法:采集我院近5年11例新生儿阑尾炎腹腔脓液行细菌培养及药敏分析,分析致病菌构成、药敏结果,随访治疗疗效。结果:11例标本分离出细菌12株,革兰阴性菌10株(83.33%),肺炎克雷伯菌6株(50%),产茁鄄内酰胺酶菌6株(50%)。主要致病菌对碳青霉烯类抗生素、阿米卡星、哌拉西林/他唑巴坦敏感率>75%。根据药敏结果制定抗感染方案,1例出现残余感染,治疗有效率为90.91%。结论:新生儿阑尾炎以肺炎克雷伯菌为主,对常见的广谱青霉素及头孢菌素耐药性高。细菌学检查对临床合理使用抗生素、减少耐药菌株形成起到重要作用。     

小儿腹泻病伴惊厥并发非肝炎病毒性肝损害80例原因分析

目的:探讨小儿腹泻病伴惊厥非肝炎病毒感染并发的一过性肝损害的病因和临床诊治要点.方法:对我院2001～2006年80例腹泻病伴惊厥患儿进行分析.结果:腹泻病伴惊厥的患儿有74%并发肝损害,轻度肝损害53例;中、重度肝损害6例.结论:腹泻病伴惊厥的患儿可并发肝功能的一过性损害,应引起临床医生的高度重视.