具有广谱中和活性的新型冠状病毒受体结合结构域抗体的筛选和鉴定

目的 从2名新型冠状病毒感染康复者体内分离针对新型冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)受体结合结构域(receptor binding domain, RBD)的特异性单克隆B细胞,并筛选出具有广谱中和活性的SARS-CoV-2 RBD中和抗体。方法 以生物素化的RBD为分子探针,利用流式细胞仪对康复者外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)进行单克隆B细胞分选,将获得的B细胞经裂解并完成逆转录后,采用随机引物对抗体的重链及轻链进行巢式PCR扩增,扩增产物分别克隆至对应的表达载体,随后相应配对的重轻链质粒共转染293F细胞中进行表达,利用Protein A柱纯化获得单克隆抗体。采用原始株(WT)假病毒开展中和实验挑选出半数抑制浓度(IC₅₀)<0.1μg/mL的抗体,进一步在原始株(WT)、Beta株(B.1.351)和Delta株(B.1.617.2)活病毒以及目前的流行株XBB、BA.5、BF.7假病毒...     

新型冠状病毒疫苗免疫BALB/c小鼠后的T细胞表位鉴定

目的 鉴定携带新型冠状病毒S、N和M基因的疫苗在BALB/c小鼠上的T细胞表位。方法 用携带新型冠状病毒S、N和M基因的DNA疫苗和痘病毒载体疫苗免疫6~8周龄雌性BALB/c小鼠,末次免疫1个月内取小鼠脾细胞,用ELISPOT法检测其对新型冠状病毒特异性多肽的T细胞免疫反应,筛选出具有阳性反应的多肽片段,并对其表位进行预测分析。结果 S、N、M基因分别鉴定出12、2、17条阳性多肽。S基因中多肽S49、S50、S100、S101、S102、S103阳性反应率为100%,且免疫刺激指数最高;覆盖M蛋白全长的41条多肽中有7条能刺激50%以上的小鼠产生阳性反应。预测分析结果显示,S、N、M基因分别有10、1、16个MHC-1 H-2限制性表位,主要位于S基因的RBD区、N基因RBD区以及M基因的跨膜区。这些表位在SARS-CoV-2及其变异株、SARS-CoV中高度保守。结论 新型冠状病毒DNA疫苗和痘病毒载体疫苗诱导了针对多个基因、多个表位的特异性T细胞应答,未来通用型疫苗设计应包含能诱导细胞免疫的多个抗原,特别是包含保守表位的结构抗原。     

HIV-1中国株CN54 Gag蛋白在毕赤酵母中的表达纯化和鉴定

目的　利用毕赤酵母表达系统高效表达HIV 1中国株CN5 4的Gag蛋白,初步确立发酵和纯化工艺。方法　PCR扩增CN5 4Gag基因,插入毕赤酵母表达载体pPS1 0 ,电转化毕赤酵母菌株GS115 ,G4 18筛选高表达工程菌,利用5L发酵罐进行高密发酵,通过SPSepharoseFF和DEAESeparoseFF柱层析,用HIV 1阳性血清和p2 4抗原检测试剂盒对纯化后的Gag蛋白进行免疫学性质的鉴定。结果　构建了高效表达CN5 4Gag蛋白的毕赤酵母工程菌株,发酵罐培养的菌体密度吸光度(A6 0 0 值)超过30 0 ,Gag蛋白表达量达到12 0mg L。纯化后的Gag蛋白纯度高于90 % ,p2 4检测强阳性并能够与HIV 1阳性血清发生特异的抗原抗体结合反应。结论　本研究在毕赤酵母中高效表达了HIV 1中国株CN5 4的Gag蛋白,并进行了纯化和鉴定,为针对我国新一代HIV蛋白亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

MicroRNA与病毒感染的新进展

MicroRNA又叫miRNA,是长约21～24个核苷酸的单链RNA,它能够通过与靶基因3'端非翻译区识别结合,抑制其mRNA的翻译,或降解靶mRNA.是降解还是抑制靶标mRNA主要取决于miRNA与之的互补程度.最近的研究证明,在宿主与病原体之间错综复杂的关系中,miRNA起到了重要的作用,并被认为与病毒感染和宿主抗病毒免疫有关.随着分子生物学的深入和对miRNA研究的发展,miRNA作为抗病毒基因治疗的候选药物具有良好的应用前景.     

探究对慢阻肺急性加重期患者应用糖皮质激素联合特布他林治疗的效果

目的将糖皮质激素联合特布他林应用在慢阻肺急性加重期患者的治疗中,观察治疗效果。方法将本院近年来收治的慢阻肺急性加重期患者共计100例作为研究对象,将全部患者随机分组比较:观察组与对照组,每组患者有50例。给予对照组患者应用特布他林治疗,观察组患者的治疗措施为糖皮质激素联合特布他林。结果观察组患者的治疗总有效率显著高于对照组患者,经比较,有显著的统计学差异(P﹤0.05)。比较两组患者的肺气功能指标改善程度,观察组显著优于对照组,两组比较,差异显著(P﹤0.05)。结论糖皮质激素联合特布他林治疗慢阻肺急性加重期患者效果佳,值得在临床中推广应用。     

酵母表达的HIV-1中国株CN54 Gag蛋白的免疫原性研究

目的评价毕赤酵母表达的HIV-1中国株CN54 Gag蛋白在Balb／c小鼠诱导体液和细胞免疫的能力。方法利用重组Gag蛋白单独及与重组DNA或痘苗联合免疫Balb／c小鼠,检测小鼠产生的特异性结合抗体和IgG1／IgG2a,同时检测T淋巴细胞增殖反应和CTL反应。结果3个蛋白单独免疫组均能诱导小鼠产生抗体和T淋巴细胞增殖反应,其中不加佐剂的免疫组诱导免疫反应低于其它两组。但3组的CTL杀伤活性均不明显。重组蛋白和重组DNA及痘苗联合免疫均诱导产生了较好的体液和细胞免疫反应,而且重组痘苗初始免疫一蛋白加强免疫组还诱导产生了较强的CrL反应。结论酵母表达的HIV-1 Gag蛋白具有良好的免疫原性,在与重组DNA和痘苗疫苗联合使用时具有协同作用,能刺激动物产生更强的HIV-1特异性体液和细胞免疫反应。本研究为构建HIV-1蛋白疫苗和探讨各类疫苗的联合免疫方式提供了有价值的参考数据。     

HIV-1 CRF07_BC gp41重组抗原在不同体系表达效率的比较

目的获得HIV-1 CRF07_BC株gp41重组抗原表达效率最佳的体系。方法采用基因工程技术将gp41重组蛋白基因分别构建到pThioHis A,pThioHis A-1(不含标签),PBV220,PGEX-6p-1原核表达载体。转化大肠杆菌BL21和Rosetta两种宿主菌,通过IPTG诱导表达并经WB鉴定。结果 4种原核表达质粒构建完成,蛋白成功表达。PGEX-6p-1表达量明显高于pThioHis A载体;而无标签载体组中,PBV220表达量优于pThioHis A-1。BL21和Rosetta宿主菌对表达体系无影响。结论 HIV-1 CRF07_BC株gp41重组抗原在大肠杆菌中以包涵体形式存在,构建在PGEX-6p-1和PBV220载体上gp41重组蛋白表达效率较高,为gp41疫苗的研究和血清学检测提供充足的抗原。     

HIV-1 CN54 Gag P55和P24蛋白的高效表达、纯化和鉴定

目的　探讨HIV 1中国株CN5 4GagP5 5和P2 4重组蛋白的高效表达并纯化 ,为研究HIV疫苗和诊断试剂创造条件。方法　分别将CN5 4GagP5 5和P2 4基因克隆至 pBV2 2 0和 pThioHisC载体 ,构建非融合表达载体 ;将重组质粒转化大肠杆菌BL2 1codonplus RIL ,对工程菌进行诱导表达。Western Blot检测目的蛋白 ,用DEAE SeparoseFF阴离子交换层析柱纯化目的蛋白 ;纯化的P5 5和P2 4抗原蛋白分别包被酶标板作ELISA检测。结果　P5 5以包涵体的形式表达 ,表达量占菌体总蛋白的 30 % ,P2 4实现了可溶性表达 ,表达量占总菌体总蛋白的4 0 % ;纯化后P5 5纯度达到 80 % ,P2 4纯度超过 90 %。Western Blot和ELISA检测均显示了良好的的灵敏度和特异性。结论　HIV 1CN5 4GagP5 5和P2 4抗原蛋白可在大肠杆菌中高效表达 ,纯化的抗原蛋白具有良好抗原性 ,可用于HIV基础研究和临床检验     

HIV-1B′亚型毒株抵抗VRC01抗体中和作用的机制研究

目的:探讨具有广谱中和活性的患者DRVI01血浆来源的HIV-1B′亚型毒株抵抗VRC01抗体中和的机制。方法:比较同期感染相同亚型且对VRC01抗体敏感的病毒序列,结合文献报道筛选可能影响VRC01中和作用的关键氨基酸,通过定点突变、不同来源膜蛋白序列交换,验证这些位点氨基酸对VRC01抗体中和作用的影响。结果:位于...     

探讨应用噻托溴胺联合沙美特罗/氟替卡松治疗中重度慢阻肺患者稳定期的疗效

目的探讨应用噻托溴胺联合沙美特罗/氟替卡松治疗中重度慢阻肺患者稳定期的疗效。方法将本卫生院在近年来收治的中重度慢阻肺稳定期患者共计112例作为研究资料,将全部患者随机分成两组:观察组与对照组,每组患者有56例。给予观察组患者应用噻托溴胺联合沙美特罗/氟替卡松治疗,给予对照组患者单独应用噻托溴胺治疗。结果统计两组患者的不良反应发生率,观察组患者稍微比对照组患者要高,但是组间比较没有显著的统计学差异(P0.05);统计两组患者的FEV1、PO2、PCO2水平,观察组患者显著优于对照组患者,经比较,有显著的统计学差异(P0.05)。统计两组患者的治疗总有效率,观察组显著高于对照组,经比较,有显著的统计学差异(P0.05)。结论对于稳定期中重度慢阻肺患者应用噻托溴胺联合沙美特罗/氟替卡松治疗,效果很显著,值得在临床中推广应用。