肠出血性大肠杆菌紧密黏附素保护性多肽的表达与免疫原性分析

目的:在基因工程菌中实现肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157∶ H7紧密黏附素(intimin)保护性片段(Int281)的高效表达,并进行抗原性的初步分析.方法:应用PCR从EHEC O157∶ H7基因组中钓取int281基因,插入pMD18-T克隆载体.克隆质粒测序鉴定后,采用NdeⅠ、NotⅠ限制性核酸内切酶双酶切pMD18-T-int281质粒获得int281基因,连接同样经过双酶切的pET-22b( ).表达质粒测序鉴定后转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,经SDS-PAGE检测相对分子质量和Western 印迹验证免疫学活性后,重组Int281蛋白免疫BALB/c小鼠,ELISA检测鼠血清抗体效价.结果:PCR扩增得到843 bp的目的片段.构建的原核表达质粒pET-22b( )-int281经酶切鉴定及测序与预期序列一致.目的蛋白以包涵体形式表达,表达量约25%.变性复性后经镍柱纯化后纯度达95%以上.免疫印迹检测显示,重组Int281片段可以特异性地识别抗O157∶ H7多抗.免疫小鼠抗体效价达1∶ 106.结论:重组Int281具有良好的免疫原性,为制备相应的抗体及研究其对EHEC O157∶ H7黏附定植的被动保护效果奠定了基础.     

新型重组人源抗狂犬病毒糖蛋白单链抗体的制备及活性分析

目的：利用大肠杆菌表达新型人源抗狂犬病毒糖蛋白单链抗体ScFv,并验证其活性。方法：采用基因融合获得ScFv基因,构建重组表达质粒pET-22b（＋）-ScFv,转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG诱导获得高效表达。结果：Western印迹显示目的蛋白表达正确,表达产物以包涵体形式存在,经Ni-NTA柱纯化和体外复性,获得纯度达90%的ScFv蛋白。ELISA结果显示在PBS及人血清中ScFv的结合稳定性有所提高,流式细胞术证明目的蛋白能靶向结合狂犬病毒,通过中和效价测定实验测得ScFv的中和效价为40 U/mg。结论：成功利用原核表达系统实现了对人源抗GPRV ScFv的表达,并且具有一定的中和活性。     

丙型肝炎治疗药物研究进展

摘 要丙肝病毒（HCV）感染是一个全球公共卫生热点问题,感染丙肝后慢性化概率极高,容易并发肝硬化等并发症,严重危害身体健康。近年,随着直接抗病毒治疗药物（DAAs）的诞生和发展,为慢性丙型肝炎(CHC)治疗带来了福音,当前泛基因型直接抗病毒药物是当前丙肝治疗的发展趋势。目前国际上已上市的DAAs主要有特拉瑞韦(telaprevir)、波塞瑞韦(boceprevir)、达卡他韦（daclatasvir）、索磷布韦 （sofosbuvir）、西米匹韦（simeprevir）;含2种及以上靶点抑制药组成的固定复方制剂主要有哈维尼（harvoni）、伊柯鲁沙（epclusa）等。本文主要综述近年来DAAs的研发进展,以期为CHC防治提供依据。     

湖北省2016-2021年麻疹病毒流行株基因型特征

目的分析湖北省麻疹病毒流行株基因型特征。方法收集湖北省2016-2021年麻疹监测病例咽拭子标本,进行麻疹病毒核酸检测、分离培养、N基因C末端基因扩增,构建分离株与基因库(GenBank)中麻疹病毒基因型参考株的系统进化树,分析核苷酸同源性和基因型别。结果从湖北省2016-2021年麻疹监测病例中共获得335株麻疹病毒流行株,其中H1基因型327株(2016-2018年)、B3基因型5株(2019年)、疫苗株A基因型3株(2016年和2021年)。H1基因型麻疹病毒分离株之间的核苷酸同源性为98.40%-98.90%,与H1基因型参考株的核苷酸同源性为97.30%-97.80%;B3基因型麻疹病毒分离株之间的核苷酸同源性为99.30%-100%,与B3基因型参考株的核苷酸同源性为97.10%-97.60%。结论2016-2018年湖北省麻疹病毒优势流行株仍为中国本土H1基因型,2019年首次发现B3基因型,2021年仅检测到疫苗株A基因型。需继续加强麻疹病毒基因型监测,及时发现和阻断输入性麻疹传播。     

湖北省2014—2023年登革病毒包膜蛋白基因特征分析

目的 分析2014—2023年湖北省登革热感染病例包膜蛋白（envelope,E）基因特征并进行生物学溯源方法 收集疑似登革热病例血清标本,对标本进行核酸检测及血清分型,核酸阳性标本采用RT-PCR扩增E基因并进行测序分型,获得基因序列用MEGA 11.0软件进行基因特征分析。结果 2014—2023年湖北省共检测登革热核酸阳性病例78份,成功获得44份标本的登革病毒（dengue virus, DENV）E基因序列,其中血清Ⅰ型(DENV-Ⅰ)39份,血清Ⅱ型(DENV-Ⅱ)5份;进化分析显示,DENV-Ⅰ中37例为基因Ⅰ型(GⅠ),分布在三个不同分支上,主要与中国广州、新加坡、印度尼西亚、泰国和缅甸等东南亚国家流行株进化距离较近,2例为基因Ⅴ型(GⅤ)与中国广州和印度流行株进化距离较近;DENV-Ⅱ中5例均为混合型(cosmopolitan型)与输入地流行株进化距离较近。结论 2014—2023年湖北省存在多型登革病毒感染,主要流行株为DENV-Ⅰ的GⅠ亚型,与中国广州和东南亚国家亲缘关系较近,提示湖北省应加强登革热跨省、跨境传播的防控,同时谨防登革重症及死亡病例的出现。     

幽门螺旋杆菌ureB、vacA基因的原核表达产物及其与感染病人血清的免疫反应性

目的 在大肠杆菌中重组表达幽门螺旋杆菌UreB、VacA蛋白,并对目的产物与感染病人血清的反应性进行验证.方法 PCR扩增获得ureB、vacA基因,分子生物学方法将基因片段克隆人pET22b( )表达载体并在大肠杆菌中诱导表达,表达产物经Ni离子亲和层析进行纯化,纯化产物采用Western Blot方法鉴定其与感染病人血清的免疫反应性.结果 构建的重组大肠杆菌高效表达UreB、VacA蛋白,Ni离子亲和层析后获得90%以上纯度的目的蛋白,与感染病人血清具有良好的免疫反应性.结论 重组UreB、VacA蛋白可作为幽门螺旋杆菌感染检测的候选分子.     

肠出血性大肠埃希菌O157:H7菌影生物学活性的初步研究

目的制备肠出血性大肠埃希菌O157∶H7细菌菌影,在细胞及动物水平对其生物学活性进行初步评价。方法将包含噬菌体phiX174裂解基因E的重组质粒pLSE转化肠出血性大肠埃希菌O157∶H7 EDL933及大肠埃希菌DH5α,42℃诱导制备菌影。利用间接免疫荧光实验观察菌影主要抗原结构,并利用电镜观察菌影对Hep-2细胞的黏附。将菌影免疫小鼠后,采用间接ELISA法检测小鼠特异性抗体,并通过小鼠攻毒实验考察菌影的保护效果。结果成功构建了重组质粒pLSE,制备出O157∶H7及DH5α菌影。O157∶H7菌影保留了病原菌的主要外膜抗原,能紧密黏附细胞Hep-2但并不侵入细胞。O157∶H7菌影免疫雄性BALB/c小鼠诱导特异性IgG抗体的产生。攻击试验结果显示小鼠对致死剂量O157∶H7 EDL933强毒株的保护率达到80%。结论 O157∶H7菌影的成功制备及生物学活性的初步析为研制O157∶H7菌影疫苗奠定了基础。     

湖北省荆门市2022年蚊虫流行性乙型脑炎病毒携带调查

目的 了解湖北省荆门市蚊虫流行性乙型脑炎(乙脑)病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)携带状况。方法 2022年7-8月在荆门市3个镇/街道选取7个点采集蚊虫标本,采用形态学方法鉴定蚊虫种类,采用实时荧光定量聚合酶链反应检测JEV核酸,计算蚊种的批阳性率和最低现场感染率,采用逆转录聚合酶链反应对JEV的E基因进行扩增和序列分析。结果 共采集4 920只蚊虫标本,其中致倦库蚊、白蚊伊蚊、骚扰阿蚊、中华按蚊分别占56.10%、41.46%、1.83%、0.61%;仅2批次致倦库蚊的JEV核酸检测阳性,批阳性率、最低现场感染率分别为6.67%(2/30)、0.07%(2/2 760)。2株JEV分离株均为基因Ⅰ型,与中国浙江省和陕西省分离株亲缘关系最近。结论 调查地区2022年蚊虫标本JEV携带率较低,蚊虫中存在基因Ⅰ型JEV循环。需持续开展蚊种JEV监测,警惕乙脑流行风险。     

人源抗狂犬病毒二硫键稳定抗体在大肠杆菌中的融合表达

目的在大肠杆菌pMAL-P2x系统中表达anti-rabiesMBP-ScdsFv融合蛋白,酶切获得目的蛋白ScdsFv,进行纯化、鉴定及简单活性分析。方法利用DNA重组技术,将全长的ScdsFv蛋白基因克隆至原核表达载体pMAL-p2x中,重组质粒转化大肠杆菌E.coliER2566,IPTG诱导表达。表达产物经Xa酶切后,经Ni柱、AmyloseResin亲和层析进行纯化,SDS-PAGE和Western blot对其进行鉴定,ELISA检测其结合活性。结果成功地构建了重组质粒pMAL-ScdsFv,经诱导表达、蛋白酶切、亲和纯化后获得目的蛋白。ELISA检测其具有抗原特异结合活性,其热稳定性有显著提高。结论抗狂犬病毒ScdsFv蛋白具有良好的结合活性和生物学活性稳定性,可作为候选分子用于狂犬病的防治研究。     

大肠杆菌细菌菌蜕的制备及初步研究

目的:利用温度控制噬菌体PhiX174裂解基因E的表达,制备大肠杆菌细菌菌蜕,鉴定其裂解效率并观察其形态.方法:利用PCR技术扩增分离了噬菌体PhiX174裂解基因E并构建其表达质粒,并将质粒转化大肠杆菌DH5α构建工程菌.工程菌培养温度从28℃突升至42℃,每15 min检测菌液D600值,诱导后4 h收集菌体.体外菌落计数计算裂解效率,并通过电镜观察菌蜕结构.结果:获得273 bp的PhiX174裂解基因E全长基因及表达质粒.菌液D600在温度突升至42℃后30 min开始持续下降,2 h后基本维持不变.4 h后收集菌体测得裂解效率为99.99%.电镜观察菌蜕为具有完整外膜结构的细菌空壳,并且无细胞毒性.结论:本研究成功利用噬菌体PhiX174裂解基因E实现了大肠杆菌细菌菌蜕的制备,为进一步的疫苗及递送系统研究奠定了基础.