利用表型筛选法测定整合子对耐药性基因盒的整合频率

目的 建立一种利用表型筛选的方法来测定整合子对耐药性基因盒的整合频率. 方法 将整合子和aadA2耐药性基因盒克隆到同一质粒pACYCl84的不同位点,该重组质粒和高表达整合酶的重组质粒分别转化大肠杆菌BL21(DE3),挑选阳性克隆过夜培养后,取适量菌液涂布含有链霉素的LB琼脂平板,同时取适量菌液涂布不含链霉素的LB琼脂平板,过夜培养后计数菌落个数,用以计算整合频率.同时以链霉素平板上的阳性克隆为模板,进行PCR扩增.对扩增产物切胶回收纯化,然后进行测序,以确定aadA2耐药性基因盒整合位点. 结果 在大肠杆菌BL21(DE3)宿主中,整合子对aadA2耐药性基因盒的整合频率为1.1×103,主要的整合位点为attI. 结论 该系统可以用于整合子对基因盒捕获频率的测定.     

K562及K562/VCR对长春新碱诱导凋亡的敏感性

研究人类白血病细胞株Ｋ５６２及耐长春新碱的Ｋ５６２变异株Ｋ５６２／ＶＣＲ对长春新碱诱导凋亡的敏感性的差异,以探讨抗凋亡在白血病多药耐药性（ＭＤＲ）中的作用。方法将Ｋ５６２及Ｋ５６２／ＶＣＲ分别用浓度为０、０．００１、０．０１０μｇ／ｍｌ的长春新碱诱导２４ｈ,用流式细胞仪ＰＩ染色法、ＴＵＮＥＬ法及ＥＬＩＳＡ法分别进行细胞凋亡检测。结果经浓度为０、０．００１μｇ／ｍｌ长春新碱诱导后,Ｋ５６２细胞凋亡率分别为（４．１０±０．１７）％、（１３．３０±３．７４）％,而Ｋ５６２／ＶＣＲ细胞凋亡率分别为（３．６１±０．６９）％、（９．０６±４．２４）％,统计学显示两者差异无显著性（ｎ＝３,Ｐ＞０．０５）。而长春新碱浓度达０．０１０μｇ／ｍｌ时,Ｋ５６２及Ｋ５６２／ＶＣＲ细胞凋亡率分别为（３６．４８±６．７０）％、（１０．４５±３．７１）％,两者差异有极显著意义（ｎ＝３,Ｐ＜０．０１）。ＴＵＮＥＬ及ＥＬＩＳＡ检测结果与此类似。结论Ｋ５６２及Ｋ５６２／ＶＣＲ对长春新碱诱导细胞凋亡的敏感性不同,耐药细胞对药物诱导细胞凋亡的抵抗性增强可能在白血病ＭＤＲ发生中有重要作用。     

健脾消癌方对结肠癌外泌体诱导HFL1活化成CAFs的影响

目的:探讨健脾消癌方对人结肠癌细胞(HCT116)来源外泌体诱导正常人胚肺成纤维细胞(HFL1)向肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)活化的影响。方法:以13.1 g·kg~(-1)的健脾消癌方灌胃SD大鼠以制备含药血清,采取超高速离心法分别提取含10%无外泌体血清培养的HCT116细胞外泌体及含20%健脾消癌方含药血清培养的HCT116细胞外泌体,纳米颗粒跟踪分析仪(Zetaview)检测外泌体的粒径分布,蛋白免疫印迹法(Western blot)鉴定外泌体的标志蛋白凋亡转接基因2互作蛋白X(Alix),热休克蛋白70(HSP70),肿瘤易感基因101蛋白(TSG101),荧光显微镜观察HFL1对细胞膜染色试剂盒(PKH67)标记的外泌体的摄取情况;将HFL1细胞分6组:空白组,转化生长因子-β1(TGF-β1)组,TGF-β1联合HCT116外泌体2 mg·L~(-1)组,TGF-β1联合HCT116外泌体4 mg·L~(-1)组,TGF-β1联合健脾消癌方外泌体2 mg·L~(-1)组,TGF-β1联合健脾消癌方外泌体4 mg·L~(-1)组,均干预48 h,Western blot和实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)分别测定α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)蛋白和mRNA的表达水平。结果:Zetaview检测粒径分布主要集中在50～100 nm,结合标志蛋白Alix,HSP70和TSG101的表达证实其为外泌体,HFL1细胞与外泌体共孵育后,荧光显微镜下可看到大量外泌体被HFL1细胞所摄取;与空白组比较,TGF-β1组和TGF-β1联合HCT116外泌体组的α-SMA蛋白及mRNA表达水平升高(P0.05);与TGF-β1联合HCT116外泌体组比较,TGF-β1联合健脾消癌方外泌体组的α-SMA蛋白及mRNA水平下降(P0.01)。结论:人结肠癌细胞外泌体联合TGF-β1可诱导HFL1活化成CAFs,健脾消癌方可通过影响α-SMA的表达水平而降低HFL1的活化能力从而达到拮抗结肠癌肺转移的作用。     

上海市常规化学项目检验结果互认基础探讨

目的分析2010至2011年上海市医院实验室常规化学项目飞行检查结果,为上海市医疗机构检验结果互认工作提供依据。方法收集2010至2011年上海市二级甲等以上医院实验室参加由上海市临床检验中心组织的2次飞行检查常规化学项目结果,计算实验室的合格率,并分别比较20个常规化学项目的全部参加实验室、三级医院、二级甲等医院和通过认可实验室检测结果间的离散度,用基于允许误差和生物学变异的分析变异质量标准评价每个项目的达标情况。结果上海二级甲等以上医院实验室间离散度分析,电解质[钾(K)、钠(Na)、氯(Cl)]3项和尿酸(UA)<3.0%,且Na≤1.6%;白蛋白(Alb)、钙(Ca)、肌酐(Cr)、总胆固醇(TC)、葡萄糖(Glu)、总蛋白(TP)均<5.0%;磷(P)、甘油三酯(TG)、尿素(Urea)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)≤7.9%;天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、γ-谷氨酰基转移酶(GGT)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)和总胆红素(TBil)离散度≤11.4%;高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)最大,术17.9%。认可实验室的Alb、ALT、AST、Ca、TC、TG、TP和CK检测质量相对优于其他组;全部医院、二级甲等医院、三级医院和认可实验室组间的均值基本无差异。ALT、CK和TG是20项常规化学检测中可达到较高质量标准的项目;其次为AST、K、TBil、UA和Urea;然后为Alb、Ca、Cr、Glu、P、TC和TP;Na、Cl、HDL-C、LDH和GGT为达到最低质量标准的项目。结论通过开展实验室全面质量管理,建立检测项目参考体系,开展中国人群基础数据研究,加强质控管理,以此为基础,逐步达到检测结果的互认,为临床提供可靠的诊疗依据。     

DNA甲基化与人类肿瘤

DNA甲基化不仅是最常见的真核DNA的修饰方式 ,而且正常的甲基化还维持着细胞和器官的正常功能。如果正常的甲基化模式遭到破坏 ,就会导致一些疾病的发生 ,如智力发育迟缓、免疫缺陷、散发性或遗传性肿瘤等。无论是生长调节基因的异常失活 ,还是整个染色体的去稳定 ,这些异常甲基化的无序状态都能促进肿瘤细胞的形成。一些基因的异常甲基化还与肿瘤化疗效果和患者的生存期直接相关 ,因此甲基化与人类肿瘤的关系越来越受到人们的重视。一、DNA甲基化在哺乳类动物中 ,胞嘧啶的甲基化是惟一已知的DNA内源性修饰。通过酶催化作用 ,甲基化基…     

肝癌组织中三种糖基转移酶基因表达水平

一、资料与方法 １．标本：１３例正常肝组织来自尸检标本;１５例ＨＣＣ组织和１５例ＨＣＣ癌旁组织取自手术患者。 ２．方法：Ｎ－乙酰氨基葡萄糖转移酶Ｖ（ＧｌｃＮＡｃＴ－Ｖ）、Ｎ－乙酰氨基葡萄糖转移酶Ⅲ（ＧｌｃＮＡｃＴ－Ⅲ）、（１,６核心岩藻糖转移酶（α１－６ＦｕｃＴ）和β－肌动蛋白（β－ａｃｔｉｎ）四种扩增基因引物由Ｐｒｉｍｅｒ３引物设计程序设计。以β－ａｃｔｉｎ为内标,采用ＲＴ－ＰＣＲ法检测以上三种基因ｍＲＮＡ的表达情况。ＰＣＲ产物经琼脂糖凝胶电泳后用ＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ ＶＤＳ图像分析系统处理并…     

胶质瘤患者RASSF1A基因转录表达和启动子区甲基化的研究

目的 探讨RASSF1A(RAS association domain family 1A)基因mRNA表达水平和基因启动子区CpG岛甲基化程度及其与启动子甲基化的关系。方法 用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测28份胶质瘤组织和4份正常脑组织中RASSF1A基因mRNA相对表达水平;用甲基化特异性PCR方法研究胶质瘤组织、正常脑组织和U251细胞株中,RASSF1A基因启动子区CpG岛甲基化状态。结果 RASSF1A mRNA在4份正常脑组织中全部表达;在脑胶质瘤中表达缺失率为21.4％(6/28),且表达量低于正常脑组织,但与患者年龄、性别、肿瘤大小、恶性程度间的差异无显著意义(P>0.05)。按病理学分类,胶质母细胞瘤与少突胶质肿瘤的差异有显著意义(P=0.011)。脑胶质瘤中RASSF1A基因启动子发生甲基化的频率为39.3％(11/28),正常脑组织和U251细胞株中,RASSF1A基因启动了未发生甲基化。11份启动子区甲基化的胶质瘤标本中,5份同时伴mRNA表达缺失(P=0.022)。结论 RASSF1A基因启动了在胶质瘤中发生异常甲基化。尽管RASSF1A mRNA在脑胶质瘤中表达缺失并不广泛,但其表达普遍下调。推测启动子区CpG岛甲基化可能是导致RASSF1A基因在胶质瘤中表达缺失或表达水平下调的一种机制。     

基于质谱的蛋白质组学诊断所面临的挑战

过去的几年中,基于质谱技术的蛋白质组学分析方法已经成为寻找新的疾病标志物的重要手段之一.由于它具有高灵敏度、高通量、快速以及能和生物信息学技术结合同时快速分析大量的蛋白质或多肽的优点,使之成为临床研究的有力工具.然而,最近的一些研究显示,因为这项技术的重复性和数据统计分析等方面的不足而受到了争议.本文介绍了采用该方法进行标志物筛查时在实验设计、质谱技术以及数据分析等方面面临的一些挑战,探讨其在血清或血浆分析中的应用.     

六年间血流感染的金黄色葡萄球菌的分子特征分析

目的 分析上海三级甲等医院2004-2010年血流感染的金黄色葡萄球菌克隆分型特点以及随时间的变化趋势,检测不同克隆株耐药和毒力基因携带情况.方法 收集上海华山医院2004-2010年从不同患者血液样本中分离鉴定的金黄色葡萄球菌103株,通过苯唑西林MIC测定和SCCrnec基因分型等方法对MRSA进行检测;按照国际通用的多位点保守基因测序(MLST)以及葡萄球菌A蛋白序列分析(spa typing)方法进行克隆株的鉴定分析,采用PCR方法对103株细菌的耐药以及毒力基因携带情况进行分析.结果 103株金黄色葡萄球菌共检出MRSA66株(64.1%),其中SCCmecⅡ型35株,SCCmecⅢ型29株,SCCmecⅣ型2株,MSSA 37株(35.9%).66株MRSA的克隆分型以ST5(33株)和ST239(29株)为主,另外还包括2株ST59.1株ST641,1株ST6;其他克隆型均为MSSA.从2009年开始ST5和ST239克隆株在血流感染中的分离率明显下降(ST5从52.9%降至15.4%;ST239从61.1%降至15.4%),而其他类型以及新出现的MSSA克隆株分离率明显增加(如2009年ST7分离率为41.7%;2010年新出现ST188及ST15等),2010年血流感染的MSSA为84.6%.103株金黄色葡萄球菌mupA耐药基因阳性19株(18.4%),qacA/B耐药基因阳性41株(39.8%),70.6%的ST239杀菌剂耐药基因qacA/B阳性.在这103株血流感染的金黄色葡萄球菌中发现5株动物来源的克隆株,分别为4株ST398以及1株ST9.22个毒力基因除了sasX、lukSF以及arcA外,同一克隆株无论MRSA还是MSSA其毒力基因携带情况无明显差异,但是不同克隆株携带毒力基因有明显的差异.结论 以ST5和ST239为主的MRSA在血流感染中的分离率明显下降,新的MSSA克隆株分离率明显增加,不同的克隆株耐药以及毒力基因的携带情况存在明显差别.     

慢性肾功能不全患者1d内不同时间点尿总蛋白/肌酐比值的变化情况分析

目的 研究随机尿总蛋白(TP)/肌酐(Cr)比值在1 d中不同时间点的变化情况.方法 选择临床建议做24 h尿蛋白检测慢性肾功能不全患者28例,所有患者随机尿内生肌酐清除率(Ccr)均＞10 mL/min.在常规收集24 h尿样本时,分段收集随机尿样本(取出1.5 mL,其余倒入24 h尿定量收集的容器内).检测每份样本的24 h尿及随机尿TP和Cr,并计算出TP/Cr比值.取高、中、低3个浓度的24 h蛋白尿样本各1份重复检测,获得该方法的室内误差值,即批间变异系数(CV).结果 TP、TP/Cr比值高值、中值和低值的CV均＜5%,在临床可接受范围内.28例患者中有11例(40%)患者1 d内随机尿TP/Cr比值波动幅度很小,与24 h TP/Cr比值很接近(P>0.05).此类患者可用随机尿TP/Cr比值来推测24 h尿蛋白量.另有17例(60%)患者1 d内随机尿TP/Cr比值波动幅度很大,随机尿TP/Cr比值波动与24 h尿TP/Cr比值的实验误差(按临床最大可接受范围计算)引起的波动之间存在明显差异(P<0.05);而且一些患者的随机尿TP/Cr比值会出现极端变化,差异甚至可高达30倍.对这60%的患者用任意一次随机尿TP/Cr比值来推测24 h尿蛋白量很难得到正确结果,即该类患者的随机尿TP/Cr比值不能用于代替24 h尿蛋白检测.部分患者即使24 h尿蛋白水平已明显异常,而多次随机尿中UP及TP/Cr比值却在正常范围内,出现假阴性结果.结论 大多数患者1 d中随机尿TP/Cr比值的变化较大,建议在有条件的情况下最好采用24 h尿TP评估肾脏蛋白漏出.