弓形虫和乙型肝炎病毒混合核酸疫苗的研究I．pcDNA3-HBsAg—GRA1真核表达质粒的构建及鉴定

目的 构建pcDNA3-HBsAg—GRA1真核表达质粒,为提高弓形虫DNA疫苗保护性做出新的探索,并期望“-／ -苗两用”。方法 采用PCR分别扩增HBsAg、GRA1;经BclI、EcoRⅠ双酶切HBsAg;EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切GRA1;BamHⅠ、XhoⅠ双酶切载体pcDNA3．0;HBsAg、GRA1、pcDNA3．0双酶切纯化产物与T4DNA连接酶在22℃连接过夜,用双酶切及双脱氧末端终止法测序鉴定重组质粒。结果 成功构建pcDNA3-HBsAg—GRA1真核表达质粒。结论 为进一步研究pcDNA3-HBsAg—GRA1诱导的保护性免疫奠定了基础。     

吡喹酮对血吸虫感染小鼠前后早期预防或治疗作用的时点观察

目的观察吡喹酮(praziquantel,PZQ)对日本血吸虫(Schistosoma japonicum,Sj)感染小鼠发挥早期预防或治疗作用的用药时点。方法健康昆明小鼠46只按设计随机分为PZQ灌服后4 h感染组(A)、感染对照组(D)和感染后2 h用药组(B)、4 h用药组(C)、6 h用药组(E)和8 h用药组(F)。人工感染方法,取阳性钉螺按常规释放尾蚴,经小鼠腹部去毛皮肤作定量感染Sj尾蚴(30±2)条/鼠。PZQ灌服按设计分组实施,以300 mg/kg体重作1次性灌胃。于感染后第42 d用生理盐水经门静脉灌注冲虫,计算每鼠虫体数,观察肝表面虫卵结节。结果感染对照组平均检获虫体(26.3±10.24)条/鼠,各鼠肝表面卵结节密布;感染前4 h用药组和感染后2 h和4 h用药两组均未发现虫体,各鼠肝表面显示正常颜色,无卵结节;感染后6 h和8 h用药两组检获虫体平均每鼠分别为(3.8±4.21)条和(14.3±9.6)条,其鼠肝表面虫卵结节存在不同程度可见。结论对实验小鼠在尾蚴暴露前后4 h时点内口服PZQ可达到有效预防或早期治疗Sj感染的作用。     

弓形虫真核表达质粒pcDNA3/GRA1的构建及序列测定

目的 :构建弓形虫致密颗粒抗原 1 (GRA1 )真核表达质粒 ,为进一步开展DNA疫苗的保护性研究打下基础。方法 :采用PCR扩增出编码GRA1目的基因 ,用EcoRⅠ /XhoⅠ分别对扩增产物和真核表达质粒pcDNA3进行双酶切 ,将GRA1定向克隆到pcDNA3EcoRⅠ /XhoⅠ位点 ;对重组质粒进行PCR ,双酶切初步鉴定后做序列测定。结果 :特异扩增出预计的GRA1片段 ,大小为 5 73bp ;扩增产物双酶切后成功连接到pcDNA3中 ,经PCR ,双酶切及序列测定结果表明重组质粒中含有GRA1读框。结论 :成功构建弓形虫GRA1真核表达质粒。     

日本血吸虫在小鼠体内不同发育时点的生长速度与蛋白组分差异

目的比较观察日本血吸虫发育中虫体在不同时点的生长速度和蛋白组分差异。方法选择昆明鼠人工感染日本血吸虫尾蚴,分别收集感染前和感染后第8、12、16、20、24和28d虫体;用MoticBA400病理图像处理系统及3.2分析软件采集虫体图象作形态观察和大小测量(包括水平面积、周长、长与宽);用SDS-PAGE平行分离各时点虫体蛋白,用图像分析软件QuantityOne4.4比较分析其区带差异。结果日本血吸虫感染昆明鼠后,发育中虫体在不同时点的生长速度不均衡,第8～12天的生长速度为最快,其他依次为12～16d、16～20d、20～24d、0～8d和24～28d的虫体;同一时点虫体间发育的个体差异也大,以12d后虫体较为明显。电泳分析7个不同时点的虫体蛋白区带显示:区带数在0、8、12、16、20、24和28d虫体中分别为27、30、33、32、31、36和29条,其中多数为相同分子量蛋白区带,但有些在蛋白表达量上有明显差异;各时点虫体特异性区带在0、8、12～24d和28d虫体中分别为7、4、8、3条,虫体特异性区带多为低表达量的条带。结论日本血吸虫童虫在小鼠体内的不同发育时点间存在着生长速度和蛋白组分的差异,其中以8～12d时段的虫体发育最快,两者间蛋白组分差异也较明显。     

弓形虫真核表达质粒pcDNA3／GRA1的构建及序列测定

目的：构建弓形虫致密颗粒抗原-1(GRA1)真核表达质粒，为进一步开展DNA疫苗的保护性研究打下基础。方法：采用PCR扩增出编码GRAl目的基因，用EcoR Ⅰ／XhoⅠ分别对扩增产物和真核表达质粒pcDNA3进行双酶切，将GRA1定向克隆到pcDNA3 EcoRⅠ／XhoⅠ位点；对重组质粒进行PCR，双酶切初步鉴定后做序列测定。结果：特异扩增出预计的GRAl片段，大小为573bp；扩增产物双酶切后成功连接到pcDNA3中，经PCR，双酶切及序列测定结果表明重组质粒中含有GRA1读框。结论：成功构建弓形虫GRAl真核表达质粒。     

晚期血吸虫病诊断方法和技术的研究进展

血吸虫(schistosoma)又叫作裂体吸虫,是寄生在宿主静脉内的一种扁形动物,借助钉螺这一中间宿主,感染人体后导致相关疾病(图1)。血吸虫病(schistosomiasis)是一种严重危害人类健康的寄生虫病,在我国流行已有2000多年的历史[1],高发区域主要集中在我国长江中下流地区以及以南的12个省[2]。尽管这些区域内已经实施了相关防控措施,部分     

斑点免疫金渗滤法的改进

目的：改进斑点免疫金渗滤法的渗滤装置，降低成本，使之更适用于现场操作。方法：用自制的圆形渗片替代塑料渗滤盒，并比较二者的效果。结果：自制的渗滤片体积更小，成本更低，为一次性使用材料；检测抗体的效果与塑料渗滤盒法一致。结论：自制的渗滤片优于常用的塑料渗滤盒。     

不同免疫途径对Sj童虫细胞型免疫原诱生的保护性效果及抗体应答差异

目的比较研究小鼠经不同途径接种日本血吸虫(Schistosoma japonicum,Sj)童虫原代细胞(primary juvenile worm cells,pJCs)后所诱导的免疫保护效果,寻找其合适的免疫途径。方法将pJCs经皮下或静脉注射途径免疫昆明小鼠,间隔2w共免疫3次,末次免疫后第4w,与对照组同时经腹部皮肤感染尾蚴30±2尾/鼠,比较三组小鼠的肝脏虫卵数及虫卵肉芽肿的大小、成虫数、虫体大小。同时在第2、3次免疫前及攻击感染前1d,小鼠尾静脉采血,用ELISA法检测抗pJCs-IgG水平。结果 pJCs免疫小鼠后,与PBS对照组比,静脉免疫组的减虫率为48.53%、肝卵减少率为54.54%、虫体平均重量减少率为29.62%(P0.01)、虫卵肉芽肿面积减少率为36.8%,而皮下免疫组分别为41.28%、43.19%、23.08%、31.2%。IgG抗体水平也是静脉注射组高(PBS组,P0.01;皮下注射组,P0.05)。结论日本血吸虫童虫细胞免疫原通过皮下和静脉注射均可诱导小鼠产生对日本血吸虫的免疫保护力,其中静脉注射诱导的免疫保护效应最强,提示通过静脉注射日本血吸虫童虫细胞是可行有效的免疫途径。     

编码弓形虫致密颗粒抗原-1(GRA1)质粒DNA免疫小鼠诱导抗弓形虫感染的保护性

目的构建真核表达质粒pcGRA1,并观察其免疫小鼠的保护性. 方法经PCR从cDNA克隆中扩增出GRA1编码基因,定向克隆入pcDNA3的EcoRⅠ/XhoⅠ位点,从而获得pcGRA1.用限制性内切酶消化、PCR及序列测定对该重组质粒进行鉴定.将100 μg质粒于小鼠左后腿DNA肌注,于注射后2周和4周各加强1次;分别观察小鼠体内的特异性抗体滴度、GRA1基因在小鼠体内的分布、GRA1在肌细胞的表达以及免疫小鼠对弓形虫强毒株RH速殖子攻击后的保护性. 结果 DNA序列测定结果表明,将573 bp的GRA1编码阅读框定向克隆到pcDNA3 EcoRⅠ/XhoⅠ位点,成功构建了重组质粒pcGRA1;免疫小鼠血清中检测到特异性IgG;不同组织DNA为模板特异地扩增出GRA1编码基因;IFA检测pcGRA1免疫鼠肌细胞呈阳性反应;弓形虫RH株速殖子攻击感染pcGRA1免疫鼠,其存活时间长于对照组. 结论重组质粒pcGRA1免疫小鼠可诱导特异性免疫反应,对弓形虫强毒株的攻击感染具有一定的保护性.     

一种从蠕虫组织切片中提取DNA作PCR鉴定虫种的简便方法

目的建立一种实用于临床病理鉴别诊断组织切片内蠕虫虫种的分子病理学方法。方法制作已知的和从临床收集的多种蠕虫和宿主组织病理切片标本,用改良蛋白K消化法对各种蠕虫切片的白片、HE染色片和免疫组化片组织提取DNA;设计合成检测并殖吸虫、曼氏裂头蚴和猪囊虫各自特异性基因片段的引物,分别对各DNA提取物作PCR扩增,经凝胶电泳观察目的基因片段;比较分析三种蠕虫各自最小组织量检测的敏感性和特异性。结果对三种蠕虫所选用的引物均可扩增出清晰的特异性目的条带。用改良蛋白K消化法提取蠕虫DNA可PCR扩增出目的片段的敏感性均优于商品化试剂盒提取法,可提出DNA的最小组织面及厚度为:肺吸虫的为1.50 mm2,10μm;曼氏裂头蚴的为4.87 mm2,5μm;猪囊虫的为5.80 mm2,5μm。经10个临床标本检测均获得理想结果。结论本研究成功地探索出一种对病理切片中微量组织提取DNA作PCR鉴定虫种的简便方法,为病理诊断提供了进一步鉴别此3种蠕虫的分子病理学手段。