结核分枝杆菌Ag85B基因疫苗免疫保护作用的初步研究

目的:研究编码结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B的基因疫苗pTB30m和pTB30s对免疫动物的保护作用。方法:以基因疫苗pTB30m和pTB30s肌注免疫BALB/c小鼠。免疫完成6 wk后,用5×105 CFU的MTB H37Rv毒株经小鼠尾静脉攻击感染。同时用尼龙毛柱分离基因免疫BALB/c小鼠的T细胞,并以5×106 T细胞/只小鼠过继免疫正常BALB/c小鼠,立即用105 CFU的MTB毒株经小鼠尾静脉攻击感染。4 wk后分别计数脾脏中的细菌负荷。结果:与生理盐水对照组相比较,pTB30m及pTB30s质粒免疫组BALB/c小鼠脾脏中的细菌负荷均减少,分别为0.645(log10 CFU,P<0.01)和0.839(log10CFU,P<0.001);而空质粒对照组小鼠脾脏中的细菌负荷减少较少。经质粒pTB30m和pTB30s免疫的BALB/c小鼠的T细胞,过继免疫的正常BALB/c小鼠,对攻击感染的MTB H37Rv毒株在脾脏中的增殖具有部分抑制作用。结论:pTB30s免疫的BALB/c小鼠,对MTB H37 Rv毒株攻击的保护作用优于pTB30m质粒免疫,有望进一步用于结核病的防治研究。     

医学微生物学二段式教学改革

我们将医学微生物学教学改为二个阶段进行 ,第一阶段 :基础医学微生物学教学 ,安排在基础课后期进行 ,主要讲授医学微生物学的基础理论和基础知识。第二阶段教学为临床微生物学 ,安排在临床教学中后期 ,由微生物学教研室、传染科、内科、检验科等联合主办。即解决与临床脱节问题 ,又通过多学科联合教学解决各学科之间内容的衔接问题     

结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64的克隆、表达与鉴定

目的 :构建表达结核分枝杆菌分泌蛋白MPT6 4重组质粒 ,并在大肠杆菌中表达获得基因重组蛋白 .方法 :用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组扩增出MPT6 4基因片段 ,插入 pGEM T easy载体中 ,序列测定正确后 ,将其亚克隆到表达载体pProEXHTb中 ,在大肠杆菌DH5α中表达 .结果 :获得结核分枝杆菌MPT6 4成熟蛋白基因 ,经序列测定与GenBank公布的序列完全一致 ;表达蛋白经SDS PAGE分析 ,相对分子质量与文献报道一致 ;重组蛋白经蛋白印迹实验 ,在Mr2 .6× 10 4位置有特异条带 .MPT6 4蛋白在宿主菌中表达量约占菌体总蛋白的 13.5 % .结论 :基因重组表达的融合蛋白有可能作为有效抗原用于结核病的预防疫苗的研制和皮肤免疫诊断试剂的制备 .     

抗创伤弧菌单克隆抗体细胞系的建立及其特性鉴定

创伤弧菌感染是海水养殖及野生海水鱼的重要疾病之一,可通过伤口和食物链感染人类,引起较严重的疾病,出现发热、寒战等症状,严重者可发生败血症,其死亡率高达 ５０％ ［１］。目前,尚缺乏对此种菌的快速检测及预防措施。我们采用杂交瘤技术,制备了抗创伤弧菌的单克隆抗体（ｍＡｂ）,以期为该菌的快速诊断及预防提供试剂。１材料和方法１．１材料创伤弧菌标准菌种由青岛海洋大学生命学院提供。 Ｂａｌｂ／ｃ小鼠（８ ｗｋ龄、雌性）由本校动物中心提供。小鼠骨髓瘤细胞Ｓｐ２／０由本室保存。１．２方法１．２． １ｍＡｂ的制备将创…     

结核分支杆菌Ag85 B分泌蛋白基因疫苗的构建和免疫原性的研究

目的：构建编码结核分支杆菌（MTB）Ag85B分泌蛋白的重组真核表达质粒,并研究其免疫原性。方法：采用聚合酶链反应（PCR）方法从结构分支杆菌H37Ra基因组DNA中扩增出Ag85B分泌蛋白基因,用HindⅢ和EcoRⅠ消化后,与同样酶消化的pcDNA3连接,转化大肠杆菌JM109,阳性克隆用酶切鉴定;重组表达质粒肌注免疫小鼠4周后,分别用dot blotting和ELISA方法检测抗体的产生和滴度,结果：酶切监定重组表达质粒pTB30s构建成功,dot blotting检测免疫小鼠血清抗Ag85B特异性抗体阳性,ELISA检测抗体几何平均滴度为1：120。结论：应进一步研究pTB30s刺激机体的细胞免疫应答,以用于结核病（TB）的防治研究。     

抗迟缓爱德华菌单克隆抗体的制备及鉴定

迟缓爱德华菌(Ｅｄｗａｒｄｓｉｅｌｌａｔａｒｄａ)是爱德华菌属中对人和鱼类均具有致病性的病原体,经口或创伤感染后,可引起肠胃炎、败血症等严重疾病〔１〕,鱼类感染后可导致肝肾损害。目前,对该菌所致疾病的诊断主要靠临诊观察和细菌学检查,难以做到准确、及时。鉴于国内外尚未见抗该菌单克隆抗体（ｍＡｂ）的报道,我们制备了抗该菌的ｍＡｂ,以为临床诊断和保护水产资源提供新的检测方法。１材料和方法１．１材料迟缓爱德华菌标准菌株,由青岛海洋大学生命学院提供;大肠杆菌和伤寒杆菌,由本校微生物学教研室惠赠。创伤弧菌和鳗弧菌购自北…     

Der p2重组胞壁型E.coli-BCG穿梭表达载体的构建和鉴定

目的：构建能够携带外源蛋白-屋尘螨抗原(Der p2)基因并能在脑壁表达的E.coli-BCG穿梭载体。方法：用PCR技术，从结核分支菌毒株H37Rv基因中，扩增结核分支杆菌19kDa抗原的脑壁区及其上游调控元件(19—ss)基因，并克隆人含有Der p2基因的c穿梭载体POLYC中。用间接免疫荧光染色法，检测该载体能够携带并表达的Der p2基因在牡牛分支杆菌宿主中表达。结果：经测序证实，所克隆的19-ss基因序列正确。所构建的含有19-ss基因的E.coli-BCG穿梭载体(pCW)能完成在大肠杆菌和牡牛分支杆菌细胞之间的穿梭，并介导抗生素抗性基因表达。经免疫荧光检查，外源基因Der p2以脂蛋白的形式表达于分支杆菌宿主的表面。结论：成功地构建了以脑壁嵌合形式表达外源蛋白的E.coli-BCG穿核载体。     

分泌表达Der p2的重组BCG的构建与鉴定

目的构建并鉴定能够分泌表达外源蛋白——屋尘螨抗原（Der p2）的基因重组卡介苗（rBCG）。方法采用PCR技术,从结核分枝杆菌H37Rv基因中扩增信号肽Alpha抗原（α-ss）的穿膜区基因,经测序鉴定后克隆入胞内表达Der p2的rBCG中。通过Western blot鉴定目标抗原在rBCG中的表达。结果经测序证实,所克隆的α-ss信号肽基因序列正确,构建的Der p2-rBCG能完成在大肠埃希菌（E.coli）和牡牛分枝杆菌细胞之间的穿梭,并介导抗生素抗性基因表达。外源基因Der p2表达于BCG培养上清。结论成功构建了以分泌方式表达外源蛋白的Der p2-rBCG。     

逆转录-半套式-聚合酶链反应在乙脑早期诊断中的应用

目的：为了探讨ＲＴ－ＰＣＲ用于乙脑临床诊断的可行性。方法：根据乙脑病毒Ｅ蛋白基因区设计了３条引物，采用逆转录－半套式－聚合酶链反应（ＲＴ－ｓｅｍｉｎｅｓｔｅｄ－ＰＣＲ）方法，从实验室到临床应用上，对该方法的敏感性和特异性、临床检测的可靠性进行了探索，并与ＩｇＭＥＬＩＳＡ捕捉法进行了比较。结果：本方法所用引物的敏感性高，特异性强。在此基础上，检测了４７例临床上确诊为乙脑患者的标本（特异性ＩｇＭ阳性），４３例ＲＴ－ｓｅｍ－ｉｎｅｓｔｅｄ－ＰＣＲ结果为阳性，与ＩｇＭ检测的符合率为９１％。在２０例特异性ＩｇＭ阴性、临床上怀疑为乙脑的患者中，１２例ＲＴ－ｓｅｍｉｎｅｓｔｅｄ－ＰＣＲ结果为阳性，阳性率为６０％。结论：上述结果提示，ＲＴ－ｓｅｍｉｎｅｓｔｅｄ－ＰＣＲ用于乙脑患者的临床诊断是可行的，若与ＩｇＭＥＬＩＳＡ捕捉法相结合可进一步提高阳性率。另外，对１６例核酸检测阳性的患者进行了追踪检查，结果有１４例患者恢复期标本的ＲＮＡ检测仍为阳性，提示该病毒并未随着症状的消失而立即消失。     

单克隆抗体鉴定鼠伤寒沙门氏菌的实验研究

本文应用沙门氏菌单克隆抗体建立了ELISA检测鼠伤寒沙门氏菌(STM)的方法,并与协同凝集方法对临床分离的162株STM进行对比鉴定研究,结果表明ELISA其方法灵敏高度,可检出5×10~2菌/ml,特异性强,且结果准确客观,对鼠伤寒沙门氏菌0-4抗原的检出率为100％,抗原H-i的检出率为96.3％,同时结果表明所用沙门氏菌McAb特异性和敏感性都达到了目前所用的沙门氏菌诊断因子血清的标准,具有推广应用的前景。