脂阿拉伯甘露聚糖的提纯及其对肺结核的诊断价值

目的 初步建立提取纯化结核分枝杆菌（M .TB）脂阿拉伯甘露聚糖（lipoarabinomanan,LAM）的方法 ,并将其用于血清标本检测,评价其对肺结核的诊断价值。 方法 M .TB菌体经冰浴超声破碎,乙醇回流,DNase I 酶RNase酶除去DNA和RNA, 热酚水法去蛋白,氯仿甲醇去酚和脂质,得到粗制的脂多糖。经Sephacryl-100凝胶过滤层析分离纯化,得到LAM。将其作为抗原,通过免疫金渗滤法检测涂阳肺结核和对照血清标本中的LAM抗体。 结果 所得LAM经SDS-PAGE银染,与对照标准品大小一致,为37 kDa。血清LAM抗体检测对肺结核诊断的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值、和涂片符合率分别为91.7%、87.8%、92.7%、86.2%、90.2%。 结论 成功提取到LAM抗原,用其检测血清结核抗体显示出理想的敏感性和特异性,有望成为结核病血清学快速诊断方法之一。     

结核分枝杆菌38kD-16kD融合蛋白克隆表达及血清学诊断价值

目的构建重组结核分枝杆菌38kD-16kD融合蛋白,评价其在结核病血清学诊断方面的价值。方法通过聚合酶链反应扩增获得16kD和38kD基因片段,分别连接到表达载体pET21a中,同时将2片段两次连接到表达载体pET21a中,形成38kD-16kD(3816),16kD, 38kD重组载体;经表达、纯化和复性后,通过Western blot分析,以酶联免疫吸附试验检测184例血清抗体,肺结核患者96例、非结核肺部疾病患者50例,正常对照38例。结果成功构建重组质粒pET21a-3816,表达蛋白经SDS-PAGE后显示相对分子质量约为65kD,重组蛋白经镍柱纯化后,纯度均达90%以上;经Western blotting证实重组蛋白能与结核病患者血清反应;重组蛋白3816血清检测,其敏感性为80.2%(77/96),特异性为90.9%(80/88)。结论成功表达和纯化了3816融合蛋白,其对血清学检测证明重组融合蛋白有希望成为结核病血清学诊断的有效候选者之一。     

DC-SIGN基因多态性与肺结核的相关性研究

目的 研究DC-SIGN基因启动子区-871A/G和-336A/G位点多态性和结核病易感性之间的关系.方法 采用病例-对照研究方法,应用焦磷酸测序技术对237例结核病患者和244例健康对照者DC-SIGN基因-871和-336位点进行基因分型,x2检验分析这两个位点多态性与结核病发生的相关性以及与结核病临床特征之间的相关性.结果 DC-SIGN基因-871位点携带有G等位基因的A/G+G/G基因型和不携带有G等位基因的A/A基因型在结核组的频率分别为37.6%、62.4%,在对照组为43.4%、56.6%,二者差别无统计学意义;-336位点携带有G等位基因的A/G+G/G基因型和不携带有G等位基因的A/A基因型在结核组的频率分别为12.2%、87.8%,在对照组为14.3%、85.7%,二者差别亦无统计学意义.中国汉族人群DC-SIGN基因-871和-336位点的G等位基因频率分别为23.2%和7.3%.-336位点A/A和A/G基因型频率在结核发热病人中的差异具有显著性(P=0.037,OR=0.191,95%CI:0.040～0.907).结论 中国汉族人群DC-SIGN基因-871和-336位点多态性与肺结核遗传易感性不相关,-336 G等位基因对于结核病人的发热可能具有保护作用.     

结核分枝杆菌CFP10和MPT48及TB8.4融合蛋白的表达与临床应用

目的 构建结核分枝杆菌CFP10、MPT48和TB8.4融合蛋白,评价其用于结核病血清学检测的价值.方法 选取2008年上海市肺科医院肺结核患者150例,非结核肺部疾病患者70例,健康体检者103名,采集血清标本共323份.构建结核分枝杆菌CFP10、MPT48和TB8.4融合表达载体.融合蛋白经免疫印迹分析后,采用酶联免疫吸附试验检测血清标本,运用Medcale11.5对结果进行统计学分析.结果 成功构建重组质粒pET21a-cfp10-mpt48-tb8.4,获得95％以上纯度的融合蛋白.免疫印迹法发现融合蛋白与血清抗体发生免疫反应.融合蛋白检测血清抗体敏感度56.7％(85/150),特异度90.8％(157/173),其中非结核病患者特异度为85.7％ (60/70),健康体检者特异度为94.2％(97/103).结论 CFP10-MPT48-TB8.4融合蛋白所具有的免疫反应性,有可能成为结核病血清学诊断的候选抗原.     

抗结核分枝杆菌脂阿拉伯甘露聚糖ELISA的建立及其临床应用

目的提取纯化结核分枝杆菌（MTB）脂阿拉伯甘露聚糖（LAM）,建立抗LAM抗体（LAM-[gG）检测的酶联免疫吸附试验（ELISA）。方法MTB菌体彻底破碎后,去除蛋白、脂质、核酸,得到粗制的脂多糖。经Sephacyl-100凝胶过滤层析分离纯化,得到LAM。以该LAM作为间接ELISA的包被抗原来检测血清中的LAM抗体。,结果所得LAM经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）银染,与对照标准品大小一致,为37000。115例肺结核患者LAM抗体阳性率71．3％;92例非结核肺部疾病患者假阳性率11．9％;188名健康体检者假阳性率3．2％。敏感性71．3％,特异性93．9％。结论本研究成功提取到LAM抗原,此抗原可作为间接ELISA的包被抗原用于结核抗体的检测。     

结核分枝杆菌分泌蛋白64抗体适体的获得及血清学检测

指数级富集配体的系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELFEX)技术筛选的适体具有可体外合成、纯度高、稳定性强和易于保存等特点,并已用于检测多种靶物质.目前利用适体检测MTB分泌蛋白64(MFT64)及模拟胸腔积液中γ-干扰素含量已有报道~([1-2]),由于MPI64是结核病血清学诊断的重要抗原之一,本研究旨在利用SELEX技术筛选MPT64抗体高亲和性适体并用于血清学检测,对获得的适体进行初步功能学评价.     

结核分枝杆菌重组蛋白Rv0222的表达及血清学鉴定

目的 构建Mtb重组蛋白Rv0222的重组质粒,评价其用于结核病血清学诊断的价值。方法 通过PCR从Mtb染色体基因组中扩增出Rv0222基因片段,插入pMD18-T载体后,再亚克隆入表达载体pET30a中,诱导表达重组菌,组氨酸标签（His-tag）亲和层析纯化蛋白,通过免疫印迹法分析重组蛋白的免疫反应性,通过间接ELISA方法检测142例血清样本,来自82例结核病患者（痰涂片或痰培养阳性,抗结核治疗症状减轻者）,28例非结核病患者（8例肺癌、15例肺炎和5例肺气肿）和32例健康体检者,检测数据通过专业医学软件MedCalc 11.5.0分析ROC曲线下面积和最佳阳性判定值。 结果 成功构建重组载体,重组蛋白Rv0222经电泳后显示相对分子质量约为27 000,镍柱纯化后蛋白纯度达95%以上,通过蛋白免疫印迹法证实重组蛋白Rv0222与结核病患者血清能特异性结合。酶联免疫检测ROC曲线下面积为0.893,最佳阳性判定值为0.12时,结核病患者组抗体检测敏感度为69.5%（57/82）,非结核病患者和健康体检者抗体检测特异度为90.0%（54/60）,结核病患者与非结核病患者及健康体检者相比,差异有统计学意义（t=25.78,P＜0.0001）。结论 成功构建pET30a-Rv0222表达载体,获得高纯度的重组蛋白Rv0222,ELISA结果显示Rv0222蛋白有望成为结核病血清学诊断的有效抗原之一。     

分泌蛋白MPT64鉴定结核分枝杆菌复合群的应用研究

v、牛分枝杆菌和非洲分枝杆菌为阳性,24株非MTB均为阴性;mpt64基因扩增的结果与ELISA法检测结果完全相符.ELISA法检测MTB临床分离株的敏感度为97.3%(110/113),57株非MTB均未检出MPT64蛋白,检测特异度为100.0%.基因扩增MTB中2株为阴性,非MTB均为阴性.结论 采用ELISA法检测分泌蛋白MPT64来鉴定MTB复合群,是一种准确、快速和简便的方法,值得临床推广应用.