Dynein抑制剂对卵母细胞体外成熟及cyclinB1 mRNA水平的影响

背景与目的 :胞浆Dynein(动力蛋白)做为微管负极方向的马达蛋白在细胞增殖进程中发挥重要作用。本实验采用原钒酸钠特异抑制Dynein生物活性后,观察卵母细胞体外培养成熟率和cyclinB1基因转录水平变化 ,探讨Dynein功能异常对卵母细胞成熟分裂进程的影响及相关机制。材料与方法 :应用卵母细胞体外培养成熟技术、半定量RT_PCR和单细胞RT_PCR方法 ,分别检测加入Dynein抑制剂前后卵母细胞成熟率和cyclinB1基因转录水平的变化。结果 :12h量效实验结果证实 ,不同浓度原钒酸钠作用后 ,5μmol/L原钒酸钠即可明显降低小鼠卵母细胞成熟率 ,0～400μmol/L卵母细胞成熟率随着剂量的增加而显著减少 ;同时检测发现 ,50～500μmol/L原钒酸钠组卵母细胞cyclinB1mRNA表达呈剂量依赖性增加。时程结果表明 ,卵母细胞与400μmol/L原钒酸钠作用1h以上 ,卵母细胞成熟率明显减少 ;体外分别培养4h或8h后再放入含有原钒酸钠培养基中培养至12h ,仍可明显抑制卵母细胞第一极体排放。400μmol/L原钒酸钠作用后 ,卵母细胞内cyclinB1mRNA时程表达水平与对照组相比...     

小鼠体外成熟与激素超排卵母细胞核型分析

目的：评价激素超排(HIO)和体外培养成熟(CVM)两种方法对小鼠卵母细胞染色体的影响。方法：通过HIO与CVM分别获得100个、80个成熟小鼠卵母细胞,制备染色体标本进行核型分析。结果：在HIO组,超单倍体率、非整倍体率、染色体结构畸变率、结构畸变卵母细胞率、退化卵母细胞率和染色体分离均数依次为2,0％、4．0％、2．0％、2．0％、8．0％和0．13;在CVM组,上述实验参数依次为4．O％、8．O％、7．5％、6．3％、12．5％和O．325;两组所有实验参数经统计学处理没有显著差异。结论：经体外培养成熟的与经激素超排的小鼠卵母细胞其质量和染色体核型没有本质上的差异。将此结果外推到人类,提示未成熟卵母细胞经体外培养成熟在人类辅助生殖领域具有广泛的应用前景。     

HBV表面抗原DNA疫苗对小鼠脏器影响的实验研究

目的：用乙型肝炎病毒（ＨＢＶ,Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ）表面抗原ＤＮＡ疫苗对小鼠进行基因免疫,观察主要脏器病理形态改变,探讨该ＤＮＡ疫苗是否对肝、肾、脾等有损伤作用。方法：用乙型肝炎表面抗原（ＧＢｓＡｇ）ＤＮＡ疫苗经肌肉注射法免疫小鼠;ＥＬＩＳＡ法检测小鼠血清抗ＨＢｓＡｇ抗体水平。免疫１２周后取小鼠肝、肾、脾等组织,观察其病原形态改变情况。结果：ＤＮＡ疫苗接种１周后,免疫组小鼠血清中可检测到抗ＨＢｓＡｇ抗体,１２周后多只小鼠脾脏明显增大,肝、肾组织切片染色观察,可见免疫组小鼠的肝、肾组织均有不同程度的病理改变。结论：ＨＢｓＡｇ ＤＮＡ疫苗可诱导小鼠机体产生特异性抗体（可诱发全面、持久的免疫应答）持续１２周以上,同时伴有脾脏肿大和肝肾损伤提示,该ＤＮＡ疫苗表达产物与免疫小鼠脏器病变有一定的关系,对其临床     

一种转导人原代肝细胞的LV-HBx诱导调控表达系统

目的：建立一种在人原代肝细胞中可诱导调控表达HBx的慢病毒表达系统,以便研究HBx生物学特性及其对人肝细胞功能的影响。方法：采用Tet-on系统构建四环素诱导调控的慢病毒-HBx表达系统,并用流式细胞术对其进行优化以达到较高的表达效率。应用该系统制备LV-HBx和LV-rtTA重组慢病毒共同转导肝癌细胞系HepG2和人原代肝细胞后,再加入强力霉素（Dox）诱导调控HBx表达,并采用实时荧光定量PCR（qPCR）检测人原代肝细胞中肿瘤转移相关基因1（MTA1）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、转化生长因子β1（TGFB1）、上皮型钙黏附素1（CDH1）、胰岛素样生长因子结合蛋白3（IGFBP3）mRNA的表达水平。结果：重组慢病毒-HBx表达系统构建成功,LV-HBx和LV-rtTA重组慢病毒用量配比经过优化,采用1：1或2：1转导后可达到较高的表达效率,Dox诱导产生的表达HBx的阳性细胞率分别为67.3%和66.7%。应用该系统将HBx基因转导入肝癌细胞系HepG2和人原代肝细胞后,可用Dox进行诱导调控HBx的高效表达。其中人原代肝细胞中Dox诱导组的HBx表达水平约为对照组（不加Dox诱导）的45倍,经qPCR检测高表达HBx的人原代肝细胞中MTA1、VEGFA、TGFB1 mRNA的表达水平较对照组均显著升高（P均 < 0.05）,而CDH1、IGFBP3 mRNA表达水平显著降低（P均 < 0.05）。结论：成功建立了转导人原代肝细胞的LV-HBx四环素诱导调控表达系统,该系统的建立为研究HBx等乙肝病毒基因对人原代肝细胞的影响打下了基础。     

HPLC法测定丝裂霉素C聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒中丝裂霉素C的含量

目的:建立高效液相色谱法测定丝裂霉素 C 聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒(MMC-PBCA-NP)中药物含量。方法:采用C_(18)柱(4.6 mm×150 mm,5 μm),以混合磷酸盐缓冲液-乙腈(85:15)为流动相,流速为1 mL·min~(-1),紫外检测器,检测波长为365 nm。结果:丝裂霉素 C(MMC)浓度在5～250 μg·mL~(-1)范围内与峰面积呈良好的线性关系,r=0.9998;平均回收率(n=6)为98.15%。结论:本法专属性强,操作简便,结果准确。适用于 MMC-PBCA-NP 的质量控制。     

弱精症患者精子基因表达谱的建立及分析

背景与目的:应用基因芯片技术建立弱精症患者精子基因表达谱.材料与方法:收集30份弱精症患者精液标本和20份成年健康有生育能力男性的精液标本,提取精子RNA,制备生物素标记的cDNA探针,与含有30968个探针的PhalanxOneArrayTM芯片杂交,分析弱精症患者与健康有生育能力成年男性精子中基因的表达情况.结果:高活力精子和低活力精子共1995个基因存在表达差异,上调基因394个,下调基因437个.功能聚类分析结果提示,弱精症患者精子中表达上调的基因集中在物理化学刺激、压力应激、炎性反应等聚类,或一些催化酶聚类,这些因素可能是导致精子活力降低的重要诱因;而弱精症患者精子中表达下调的基因主要集中在一些与精子发生和抗凋亡相关的基因聚类中.结论:弱精症患者精子基因表达谱的建立对分析精于运动的分子机制和探讨弱精症的病因将会有所帮助.     

抗金黄地鼠精液抗体作为杀精子剂的实验研究

背景与目的： 探讨抗精液抗体作为阴道内杀精子剂的可行性。 材料与方法： 制备抗金黄地鼠精液抗血清,用抗血清与金黄地鼠精液混合后,做体外精子活率分析、精子凝集实验;用流式细胞仪分析精子线粒体功能,取雌鼠卵细胞做体外受精及精卵融合试验;并做抗血清处理后精子的子宫内注射实验和交配后阴道内精子活率测定,以探讨抗精液抗体在体外和体内制动精子的作用。 结果： 抗精液抗体能够完全凝集和制动精子,流式细胞仪检测结果显示抗血清处理组精子线粒体荧光强度为180.28±82.24,明显低于对照组(309.74±148.37),差异具有统计学意义(P<0.01);体外受精实验中处理组的受精率为0.9％,显著低于对照组的37.50％(P<0.01);子宫内精子注射实验中实验组受精卵率为1％,显著低于对照组的15％(P<0.01);交配后阴道内精子活率测定显示,实验组中所有精子均不活动,而对照组精子活率为60％。 结论： 抗精液抗体在体外、阴道和子宫内都能够完全凝集和制动精子,可以阻止精卵融合。抗精液抗体可以作为阴道内杀精子剂。     

pIRES2-EGFP-DAZ3质粒构建及金黄地鼠2-细胞胚中人DAZ基因的复制与表达

背景与目的：人Yq11.2上AZF区 (内含DAZ基因家族) 的缺失是多数男性不育的病因。本研究旨在探讨DAZ3基因导入精子的可能性以及导入基因在2-细胞胚中的功能。材料与方法：构建pIRES2-EGFP-DAZ3质粒,经鉴定无误后将其导入金黄地鼠精子。将携带DAZ3基因的精子与金黄地鼠卵母细胞进行体外受精。用FISH、PCR、RT-PCR技术分别检测DAZ3基因在精子头部、雄原核上的整合以及在2-细胞胚中的复制与表达。结果：构建的pIRES2-EGFP-DAZ3质粒经酶切、PCR和绿色荧光蛋白表达鉴定构建成功。采用FISH在精子头部、单细胞胚雄原核和2-细胞胚两个间期核上观察到阳性杂交信号。采用RT-PCR在2-细胞胚样本中观察到DAZ3 cDNA的特异条带。结论：外源性DAZ3基因能被导入精子基因组。携带DAZ3基因的精子可与卵母细胞完成正常的受精过程。导入的DAZ3基因在早期胚胎细胞中能够随细胞分裂自我复制并表达其功能。本研究结果为DAZ基因缺失所致男性不育的治疗提供了新的线索。     

HIV/AIDS患者精子中病毒核酸的检测

目的 检测HIV/AIDS患者精子中HIV核酸。 方法 制备33位HIV/AIDS患者精子样本,采用荧光原位杂交（FISH）,以生物素标记的HIV gag及 HIV pol作为双探针对这些患者精子进行HIV核酸检测。 结果 在9例(27.2%)患者中检测到阳性荧光信。结论 本结果进一步证实HIV/AIDS患者精子存有HIV核酸,并提示FISH是一种检测患者精子病毒核酸灵敏而可靠的方法。     

HIV/AIDS 28例患者精子形态特点分析

目的分析HIV/AIDS患者精子的形态学特点,探讨HIV感染对精子形态学的影响。方法收集已确诊HIV/AIDS患者,采用精子分析仪分析其精子形态学特点。结果收集了28例HIV/AIDS患者,分析精子的形态学结构发现,患者精子畸形率在24.2%~93.9%之间,平均（67.7±11.2）%,精子畸形以头部畸形为主,尤以小头畸形常见（54.2±15.7）%;其次可见大头、无定形头、圆形头等。颈部畸形率为（4.16±4.23）%,以颈部粗壮、不规则为主。尾部畸形率为（3.28±4.93）%,主要以尾部弯曲为主。结论 HIV/AIDS患者精子形态学存在明显的异常,HIV感染对患者精子的形态有明显的影响。