探针熔解分析法检测结核分枝杆菌异烟肼耐药突变的应用和评价

目的 评价PMA技术检测MTB对INH耐药突变的价值,调查INH耐药突变发生特征.方法 MTB标准株H37Rv来自国家结核病参比实验室,1株INH敏感株和1株katG S315TACC突变株来自厦门市疾病预防控制中心,7株含有已知INH耐药突变的结核耐药株来自深圳慢性病防治中心、河南省疾病预防控制中心、中国人民解放军第309医院和厦门市疾病预防控制中心.707份MTB临床分离株来自厦门市疾病预防控制中心、厦门市第一医院和漳州市疾病预防控制中心,126份MTB涂阳痰标本来自厦门市同安区疾病预防控制中心.MTB标准株H37Rv、7株MTB INH耐药株和833份临床标本均采用厦门致善结核分枝杆菌异烟肼耐药突变检测试剂盒热裂解法提取基因组DNA,1株INH敏感株和1株katG S315T ACC突变株采用AxyPrepTM细菌基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA.熔解曲线分析所检标本与野生型对照在katG315位密码子、inhA启动子区(- 17～-8位点)、ahpC启动子区(-44～-30以及-15 ～3位点)及inhA94位密码子的熔解温度(Tm值)差异判断标本是否发生INH耐药突变.3×105拷贝/反应的野生株和katG S315T ACC突变株以10倍梯度稀释至300拷贝/反应,分析PMA技术的灵敏度.用PMA技术检测7株含有已知INH耐药突变的结核耐药株,评价特异性,并就其中5种耐药突变进行重复性检验.测序验证PMA技术对833份标本INH耐药性的临床检测效能.结果 PMA技术从核酸提取到结果判断可在3小时内完成,在标准96孔实时PCR仪器上可同时检测46份标本.对野生株和katG S315T ACC突变株的灵敏度均为300拷贝/反应,能够同时区分9种INH耐药相关点突变或缺失,5种耐药突变的Tm值标准偏差均在0.5℃之内.检出的162份突变标本与测序验证结果均一致.临床标本验证突变率为19.4％( 162/833),在所检出的14种INH耐药突变katGS315T( AGC →ACC)、inhA启动子区- 15C→T和katG S315N (AGC→AAC)这3种突变占INH耐药突变标本的83.3％(135/162).结论 PMA技术可快速、灵敏、特异检测结核INH耐药突变.