稳定高表达RORα基因的人胃癌MGC803细胞系的构建与鉴定

目的 构建维甲酸相关孤核受体α(RORα)基因的真核表达载体,并建立稳定高表达RORα的人胃癌MGC803细胞,为研究RORα的功能奠定基础。方法根据RORα基因的cDNA全序列,设计一对带有限制性酶切位点的引物。从人胃癌MGC803细胞中提取mRNA作为模板合成RORα cDNA第一链,并用上述引物扩增目的基因全序列,然后经双酶切插入到真核表达载体pcDNA3.1(+),转化大肠杆菌DH5α;用氨苄青霉素筛选pcDNA3.1(+)-RORα的阳性菌株,双酶切和测序进行鉴定。用经鉴定的重组质粒pcDNA3.1(+)-RORα转染MGC803细胞,G418筛选获得RORα/MGC803细胞株;Real-time PCR和Western blot检测该细胞株RORα的表达情况。结果经双酶切鉴定,构建的真核表达载体pcDNA3.1(+)-RORα包含有大约1 640 bp的插入片段,与预期大小一致;表达载体经测序鉴定,其插入片段碱基序列与RORα基因的cDNA序列完全一致。用构建的真核表达载体pcDNA3.1(+)-RORα转染MGC803细胞后,筛选到可稳定传代的RORα/MGC803细胞株。Real-time PCR与Western blot检测显示,RORα/MGC803细胞RORα mRNA和蛋白表达增高。结论成功构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-RORα和建立高表达RORα基因的RORα/MGC803细胞。     

转染胃动蛋白2基因抑制人胃癌细胞系MKN28增殖、迁移和侵袭

目的检测胃癌、癌旁组织和胃癌远端胃黏膜组织中胃动蛋白2(GKN2)的表达;分析GKN2转染人胃癌MKN28细胞系后对增殖、迁移和侵袭的影响。方法免疫组织化学技术检测胃癌、癌旁组织和胃癌远端胃黏膜中GKN2蛋白的表达;将GKN2基因真核表达载体(Xhol_GKN3SP-h GKN2-TEV-SBP_Xhol)转入人胃癌MKN28细胞,经G418筛选后获得稳转细胞株,Western blot确定GKN2在MKN28细胞中表达;MTT法测定MKN28细胞增殖;Transwell迁移实验和侵袭实验检测细胞迁移和侵袭。结果 GKN2在胃癌组织中的表达少于胃癌远端胃黏膜和癌旁胃组织(P<0.05)。GKN2转染人胃癌MKN28细胞后吸光度值(A值)显著低于未转染组和空载体组(P<0.05)。与未转染组及空载体组相比,GKN2过表达致使迁移细胞数(P<0.05)和侵袭细胞数均明显下调(P<0.05)。结论 GKN2表达减低与胃癌的发生有关;GKN2过表达显然可阻抑人胃癌MKN28细胞的增殖、迁移和侵袭。     

二烯丙基二硫对小鼠肾包膜下移植人胃癌细胞的生长抑制作用

二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)是大蒜的主要有效成分,对多种肿瘤均有明显的抑制作用[1].本室体外研究表明:DADS可明显抑制人胃癌MGC803细胞生长[2],其机制与G2/M期阻滞和信号传导通路ERK/AP-1途径有关[3,4].本研究采用人肿瘤细胞肾包膜下移植模型,探讨DADS对体内生长的MGC803细胞的抑制作用.     

二烯丙基二硫对人胃癌MGC803细胞G_2/M期的阻滞作用

目的　探讨二烯丙基二硫 (DADS)对人胃癌MGC80 3细胞G2 /M期的阻滞作用及分子机制。方法　体外培养MGC80 3细胞 ,采用MTT比色实验、细胞计数法 ,流式细胞光度术和Westernblot分析DADS对MGC80 3细胞的抑制增殖作用 ,细胞周期分布的影响及细胞周期相关蛋白的表达。结果　MTT法显示 ,2 0mg·L-1DADS、30mg·L-1DADS作用MGC80 3细胞 72h后 ,生长抑制率分别达2 5 7%、5 8 6 %。细胞计数法表明常规培养MGC80 3细胞群体倍增时间为 2 9 92h ,30mg·L-1DADS作用MGC80 3细胞后 ,其细胞群体倍增时间延长到 5 5 5 8h。流式细胞仪分析结果显示DADS呈浓度依赖性将MGC80 3细胞阻滞在G2 /M期。 30mg·L-1DADS作用MGC80 3细胞 36h ,与对照组相比 ,可使G2 /M期细胞增加到 4倍多。Westernblot分析表明在G2 /M期阻滞同时有Cdc2 5C蛋白表达下降 ,但CDK1蛋白表达不受DADS作用的影响。结论　DADS对MGC80 3细胞的抑制增殖作用与G2 /M期阻滞有关 ,DADS对MGC80 3细胞G2 /M期阻滞的分子机制可能与降低Cdc2 5C蛋白水平有关     

二烯丙基二硫诱导人胃癌细胞G_2/M期阻滞中p-CDK1、cyclin B1和p21~(WAF1)蛋白的表达

二烯丙基二硫(diallyl disulfide, DADS)是大蒜中提取的一种低分子量的脂溶性成分,也是大蒜中的主要有效成分,对结肠癌、乳腺癌、肝癌、肺癌、膀胱癌、前列腺癌和白血病等多种肿瘤均有明显的抑制作用.本实验室以前研究表明[1],DADS对人类白血病细胞HL60有诱导分化作用,对体外[2]和体内[3]的人胃癌MGC803细胞均有生长抑制作用、G2/M期阻滞作用.对体内的人胃癌细胞有诱导分化作用[3],对体外的人胃癌细胞有诱导凋亡作用[4].     

甲状腺滤泡性腺瘤与滤泡性腺癌形态定量分析

利用 PIPS-2 0 2 0型超清晰图象分析系统对 2 7例甲状腺滤泡性腺瘤和 2 4例甲状腺滤泡性腺癌进行胞核形态定量研究。结果显示 ,甲状腺滤泡性腺瘤与甲状腺滤泡性腺癌 8项胞核形态定量参数经统计学处理比较 ,核面积、核周长、核等效直径、核面积体积、核长径、核短径、核长短比、核形状因子等 8项指标均有高度显著性差异 ( P<0 .0 1) ,提示上述形态定量参数可作为鉴别甲状腺滤泡性良恶性肿瘤的参考指标。     

RORα miRNA转染对DADS抑制胶质瘤U251细胞增殖的影响

背景与目的:维甲酸相关孤核受体α(retinoid acid receptor related orphan receptor α,ROR α)可能参与肿瘤的调控.本实验室前期研究发现,二烯丙基二硫(diallyl disulfide,DADS)可抑制人胶质瘤U251细胞增殖,其抑制增殖作用可能与诱导ROR α蛋白表达上调有关.为了明确ROR α在DADS抑制人胶质瘤细胞增殖中的作用,本研究采用miRNA干扰技术抑制ROR α表达,观察其对DADS抑制U251细胞增殖的影响.方法:首先将ROR α miRNA转染人胶质瘤U251细胞,运用Western blot检测转染前后ROR α蛋白表达情况.实验分为未转染组、脂质体转染组和ROR α miRNA转染组及分别经30 mg/L DADS处理后的3组,共6组.MTT法检测ROR α表达下调对DADS抑制胶质瘤U251细胞增殖的影响.结果:Western b1ot结果显示,转染ROR α miRNA细胞的ROR α蛋白表达(0.09±0.05)明显低于未转染组(0.81±0.11)和脂质体转染组(0.89±0.15),其蛋白表达下调了89.5%(P＜0.05).MTT结果显示,U251细胞增殖活性在RORα miRNA转染后48hA570值为(0.98±0.15),高于未转染组(0.47±0.11)和脂质体转染组(0.45±0.10)(P＜0.05),其增殖率高达108.5%.并且ROR α miRNA转染削弱了DADS对U251细胞的增殖抑制作用,转染ROR α miRNA细胞加入DADS后的细胞增殖率(A570值为0.69±0.20)明显高于DADS处理的未转染组(0.28±0.13)和脂质体转染组(0.25±0.12)(P＜0.05),其抑制率由40.4%下降为29.6%.结论:miRNA干扰ROR α表达可促进U251细胞增殖,并且削弱了DADS对U251细胞的增殖抑制作用,说明ROR α参与了DADS抗胶质瘤U251细胞增殖的作用.     

Cdc25C cyclin B1在二烯丙基二硫化物诱导人胃癌BGC823细胞G2/M期阻滞中的作用

目的：研究二烯丙基二硫化物（DADS）对人胃癌BGC823细胞的增殖及细胞周期的影响以及Cdc25C、cyclin B1的作用。方法：采用MTT法检测BGC823细胞的生长活性；流式细胞术分析DADS对细胞周期分布的影响；Western blot观察DADS对Cdc25C蛋白、cyclin B1蛋白表达的影响。结果：MTT比色实验结果显示，DADS对人胃癌细胞具有明显的生长抑制作用，且呈显著的剂量-效应依赖关系（P〈0．05）。流式细胞分析发现，DADS作用12h时，G2/M期细胞增加到30．1％；24h时增加到58．1％；36h达50．2％（P〈0．05）。Westernblot结果表明，DADS呈时间依赖性抑制人胃癌BGC823细胞周期Cdc25C磷酸酶的表达，cyclin B1表达在DADS处理24h后开始下降（P〈0．05）。结论：DADS可抑制人胃癌BGC823细胞增殖，其增殖抑制与细胞周期G2/M期阻滞有关；DADS可能是通过抑制Cdc25C、cyclin B1表达使部分BGC823细胞停滞在G2／M期。