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目的探讨重组人组织型激肽释放酶(HK)基因腺相关病毒载体(rAVV/HK)对体外培养的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)作用.方法将HK基因定向克隆入腺相关病毒质粒pAAV-MCS中,形成重组腺相关病毒(rAAV-HK)质粒,经聚合酶链反应(PCR)检测和DNA测序后,将rAAV-HK、pAAV-Helper和pAAV-RC 3种质粒通过脂质体共转染293细胞,包装成带有HK目的基因的重组rAVV/HK,采用β半乳糖苷酶原位染色法测定报告基因rAVV/LacZ在HT1080中的表达,间接计算病毒滴度,并观察转染基因在传代细胞中的表达.在相同的条件下体外分别培养HUVECs(对照组)和rAVV/HK转染的HUVEC(HK转染组)48 h,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测两组HUVECs HK mRAN的表达,并利用硝酸还原酶法和分光光度法分别检测两组HUVECs一氧化氮(NO)含量和一氧化氮合酶(NOS)活性.结果 rAVV/HK病毒滴度为6.2×107个/mL,LacZ基因能够在第一传代和第六代HT1080细胞内稳定持续表达.与对照组比,HK转染组HUVECs HK mRNA表达增加(P<0.001);而且HK转染组HUVECs细胞培养液中NO的含量和NOS活性明显增高,P值分别<0.01和<0.05.结论 HK基因通过重组腺相关病毒载体可成功转染体外培养的HUVECs,使其HK mRNA表达增加,NOS活性和NO含量升高,此结果为基因治疗人类血管内皮细胞异常提供客观依据. 相似文献
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血浆载脂蛋白B基因3′端可变数目串联重复序列的结构研究 总被引:1,自引:0,他引:1
目的研究载脂蛋白B(apolipoproteinB,apoB)基因apoB3′端可变数目串联重复序列(variable numberoftandemrepeats,VNTR)多态性与序列结构。方法应用聚合酶链反应结合琼脂糖凝胶电泳技术检测了522名随机抽取的体检人员apoB基因3′VNTR多态性,选取26个样本的PCR产物进行DNA序列测定。结果分离出16个等位基因即高变单元(hypervariableelement,HVE),其中杂合子多于纯合子,最大的等位基因是HVE58,最小的是HVE24;HVE34频率最高40.4%,其次是HVE32,占34.7%。对26名60个等位基因进行的DNA核苷酸测序中,发现一个等位基因异构体(Y A=ATAATTAAATATTT),4个结构模式。结论中国人与欧美人群在apoB基因3′VNTR等位基因频率分布上存在明显差异,在等位基因异构体与结构模式上也存在不同。 相似文献
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目的克隆人胰腺组织激肽原酶基因,构建分泌型原核表达载体。方法使用RT-PCR的方法扩增人胰腺组织cDNA,从中扩增出激肽原酶基因。将扩增的激肽原酶基因用XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切后,连接到同样双酶切处理的pET-20b(+)载体上,酶切鉴定后,进行核苷酸序列分析和融合蛋白的表达。结果将IPTG诱导表达的菌体进行SDS-PAGE,在相对分子质量31.4×103处可见明显的高表达带。蛋白质免疫印迹实验表明,重组蛋白具有激肽原酶的抗原性。结论成功克隆人胰腺组织激肽原酶基因,并高效表达融合蛋白,为进一步开发基因工程药物打下基础。 相似文献
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人胰激肽释放酶基因的克隆及融合蛋白的表达 总被引:1,自引:0,他引:1
目的开发激肽释放酶基因工程产品,为开展基因治疗高血压奠定基础。方法提取人胰腺组织总RNA,逆转录后PCR扩增激肽释放酶cDNA。回收、补平后插入质粒KS,构建出中间载体KSKK,酶切鉴定后双向测序分析激肽释放酶基因序列。从KSKK中切出激肽释放酶原及激肽释放酶基因,插入真核表达载体PET-28b(+),经酶切鉴定后,进行核苷酸序列分析和融合蛋白表达。结果本实验克隆的激肽释放酶基因与GenBank报告的激肽释放酶基因相比,有一个碱基不同,同源性为99.8%。将IPTG诱导表达进行SDS—PAGE电泳,与蛋白标准品比较在31800处可见明显的高表达带。免疫印迹实验表明重组蛋白具有KK的抗原性。结论已成功克隆并表达了人组织激肽释放酶基因,为进一步开发基因工程产品及进行基因治疗高血压研究奠定了基础。 相似文献
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目的对中国人的组织因子途径抑制物-2(TFPI-2)基因进行克隆并测序。方法从人新鲜肝组织提取总RNA,经逆转录PCR(RT-PCR)扩增出TFPI-2的全长cDNA,经亚克隆、筛选、鉴定后,进行正反测序。结果中国人TFPI-2基因cDNA全长1222bp,除258bp、585bp和884bp处与目前GenBank中收录的国外学者克隆的TFPI-2基因序列不同外,其他完全一致。其序列Gen-Bank登记号TFPI AY691946。结论中国人TFPI-2基因序列与已经报道的西方人的TFPI-2基因序列基本相同,但三处单核苷酸多态性的意义何在,目前尚不清楚。 相似文献
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根据硫氰化铬铵在酸性介质中可与大分子季铵盐类药物定量生成难溶于水的络合物的原理 ,用过量的硫氰化铬胺试剂 ,与益母草浸膏中的盐酸水苏碱反应 ,沉淀后用比色法测定滤液中的剩余试剂 ,间接测定益母草浸膏的含量。其回收率为 10 0 95% ,RSD =1 78% 相似文献
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目的:分析慢性中重度牙周炎患者局部应用盐酸米诺四环素(MINO)后,不同牙周状态下龈沟液(GCF)中IL-8总量和浓度的差异及其与临床指标的关系;评价局部应用MINO在牙周病药物治疗中的疗效。方法:采用随机单盲法抽取用药组与对照组38例。用药组将盐酸米诺四环素软膏置于牙周袋内作为局部药物治疗;以单纯基础治疗为对照组。分为用药组27颗患牙,108个位点;对照组11颗患牙,44个位点。于基线前两周完成全口龈上洁治及口腔卫生宣教。基线时收集相应牙位龈沟液(GCF)样本,用ELISA法检测各样本中IL-8的总量和浓度,并观察基线时龈沟出血指数(SBI)、牙周探诊深度(PD)、牙周附着水平(AL);然后行龈下刮治术,用药组龈沟内放药,对照侧不放药。第2周牙周指标检查同上。结果:用药组龈沟液中IL-8浓度和总量水平与其基线和对照组相比明显下降(P<0.05),其临床指标用药组与对照组相比改善明显(P<0.05)。结论:盐酸米诺四环素软膏(MI-NO)辅助治疗牙周炎,能有效降低龈沟液中IL-8的总量和浓度,改善牙周组织状况。 相似文献