O型口蹄疫病毒蛋白酶编码序列及氨基酸序列变化的分析

目的与方法从GenBank中下载了19株O型口蹄疫病毒的Lab、3C、3D基因,结合本实验室收录的FMDVOA/58Lab、3C、3D的序列信息,分析比较了三种FMDV蛋白酶(Lpro,3Cpro,3Dpol)的编码序列和氨基酸序列。结果这FMDV具有的蛋白酶的编码序列在突变上没有显著差异(P>0.05),而在氨基酸序列的突变上存在着显著差异(P<0.01)。通过多重比较发现Lpro与3Cpro和3Dpol在氨基酸突变上存在差异(P<0.05),而3Cpro和3Dpol之间突变差异不显著。结论利用Swiss-pdbViewer蛋白质分析软件模拟三种蛋白酶中各个突变热点氨基酸残基的替换,发现突变热点不影响三种蛋白酶的空间结构。这表明病毒基因组在复制过程中的突变只是FMDV变异的原始动力,而FMDV变异的方向性进化动力是感染FMDV的宿主细胞对病毒蛋白酶功能造成的选择压力。     

AsiaI口蹄疫病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

目的：制备AsiaI口蹄疫病毒VP1蛋白单克隆抗体（mAb）并进行鉴定。方法：用纯化的AsiaI型口蹄疫病毒VP1表位重组蛋白为抗原免疫6～8周龄的雌性BALB／c小鼠，经过3次免疫后，取其脾细胞与sp2／0骨髓瘤细胞融合。采用有限稀释法和间接ELISA克隆和筛选阳性杂交瘤细胞株，用SDS-PAGE电泳、间接ELISA以及微量细胞中和试验对所获得的mAb的特异性进行鉴定。结果：成功获得3株能稳定传代并分泌抗AsiaImAb的杂交瘤细胞株，分别命名为：188、5E1、5E2，其分泌的mAb为IgG1（188）和IgG2a（5E1、5E2）亚类，他们均能特异性的识别VP1重组蛋白和AsiaI型全病毒，其腹水效价在1：10^5～1：10^6。微量细胞中和试验表明该mAb能很好地识别灭活的FMDV，中和效价达1：1024以上。交叉试验表明该mAb具有高度特异性，型间无交叉反应，证明所获得的mAb均完全针对AsiaI FMDV抗原决定簇。结论：在口蹄疫病毒mAb的研究中，VP1重组蛋白有望代替活病毒来制备mAb。AsiaI口蹄疫病毒VP1 mAb的成功制备，为进一步研究和开发新型口蹄疫的检测方法和抗原表位奠定了基础。     

硫酸乙酰肝素受体介导的病毒感染作用

病毒受体多为蛋白聚糖、糖脂或脂、糖蛋白且以单个或多个分子的复合体形式才能存在,硫酸乙酰肝素(Heparan sulfate,HS)存在于细胞表面,是病毒特异性结合的主要糖蛋白受体,最初发现以硫酸乙酰肝素为受体的病毒是人类单纯疱疹病毒(HSV-1)和(HSV-2).硫酸乙酰肝素可作为多种病毒的受体,其可与病毒的多个吸附位点结合,它作为病毒受体来介导病毒进入细胞特定的部位或促进病毒与其第二受体的吸附.以硫酸乙酰肝素为受体的病毒有疱疹病毒、登革热病毒、口蹄疫病毒、人乳头瘤病毒、人免疫缺陷病毒、辛德毕斯病毒等多种病毒.研究发现,酸乙酰肝素可作为多种病毒的第一受体(表1).     

猪FMDV受体β3亚基配体结合域的基因克隆及其多克隆抗体制备

目的:克隆猪FMDV受体β3亚基的配体结合域(LBD)基因,利用原核细胞表达β3亚基的LBD片段,纯化目的蛋白后制备兔多克隆抗体.方法:利用RT-PCR方法从FMDV实验感染猪的肺组织中克隆β3亚基的LBD基因,将其与pGEM T-easy载体相连构建pGEM/β3LBD,经BamH Ⅰ/Xho Ⅰ酶切后回收β3LBD片段,与同样酶切处理的原核表达载体pGEX 4T-1相连,构建原核表达质粒pGEX/β3LBD,将其转化感受态细胞BL21(DE3),以IPTG诱导表达β3LBD蛋白.纯化目的蛋白后免疫新西兰白兔制备多克隆抗体.通过ELISA和Western blot鉴定血清效价和特异性.结果:猪β3亚基的LBD基因含有507个核苷酸,编码169个氨基酸,猪β3 LBD基因与牛、人、黑猩猩、猕猴、马、犬、挪威大鼠、家鼠、和鸡的β3 LBD基因核苷酸序列同源性分别为90.3%、92.3%、92.1%、91.3%、90.5%、90.3%、87.8%、85.2%、79.5%.哺乳动物的β3亚基LBD基因同源性较高,与鸡的同源性较低.实现了重组猪β3 LBD蛋白在大肠杆菌中的高效表达,SDS-PAGE显示其相对分子质量(Mr)约为44 000,制备的兔多克隆抗体效价达1:12800以上.结论:实现了猪FMDV受体β3 LBD的基因克隆、原核表达和多克隆抗体的制备,为深入研究受体β3亚基在FMDV感染过程中的作用机制奠定了基础.     

用protein G纯化口蹄疫病毒单克隆抗体的特性分析

目的为了获得高效价和高纯度的O型口蹄疫病毒单克隆抗体。方法用O型口蹄疫乳鼠毒(LD50=10-8.5)感染免疫小鼠,按有限稀释法和ELISA方法筛选出阳性杂交瘤细胞株,制备单抗腹水,所收腹水用50%和45%的饱和硫酸铵沉淀,再用proteinG亲和层析柱进行亲和层析纯化单体,并用SDS-PAGE和单抗检测方法分析其纯化抗体的纯度和活性。结果经3次亚克隆获得了一株杂交瘤细胞株(10E6),抗体亚类鉴定为IgG2a;SDS-PAGE电泳显示,纯化的抗体纯度较高,只有IgG2a的重链和轻链,而没有其它杂蛋白带;单抗ELISA检测方法显示,纯化的抗体具有良好的活性,其效价为1∶102400,高于腹水效价。结论用proteinG亲和层析法获得了高纯度和高效价的单克隆抗体,将为O型口蹄疫病毒的基础研究和应用研究奠定基础。     

H9N2亚型禽流感病毒HA基因的原核表达及其免疫反应性分析

目的对禽流感病毒HA基因进行原核表达并对其产物进行免疫反应性分析。方法采用PCR方法扩增禽流感病毒A／Ck／GS／2／99（H9N2）的HA基因（1723bp）；并将该片段克隆至pET-28a（＋）质粒，构建重组质粒pET-HA，用该重组质粒转化E．coliBL21（DE3）感受态细胞，以终浓度0．7mmol／L的IPTG诱导表达7h。结果成功构建了表达载体pET—HA，该载体能高效表达HA蛋白，相对分子质量约62kDa，在约62kDa处出现一条明显的特异性蛋白条带。结论成功表达了禽流感病毒HA蛋白，该蛋白纯化产物能与H9亚型的AIV鸡血清发生特异性反应。     

AsiaⅠ口蹄疫病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备AsiaI口蹄疫病毒VP1蛋白单克隆抗体(mAb)并进行鉴定。方法:用纯化的AsiaI型口蹄疫病毒VP1表位重组蛋白为抗原免疫6～8周龄的雌性BALB/c小鼠,经过3次免疫后,取其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合。采用有限稀释法和间接ELISA克隆和筛选阳性杂交瘤细胞株,用SDS-PAGE电泳、间接ELISA以及微量细胞中和试验对所获得的mAb的特异性进行鉴定。结果:成功获得3株能稳定传代并分泌抗AsiaImAb的杂交瘤细胞株,分别命名为:1B8、5E1、5E2,其分泌的mAb为IgG1(1B8)和IgG2a(5E1、5E2)亚类,他们均能特异性的识别VP1重组蛋白和AsiaI型全病毒,其腹水效价在1:105～1:106。微量细胞中和试验表明该mAb能很好地识别灭活的FMDV,中和效价达1:1024以上。交叉试验表明该mAb具有高度特异性,型间无交叉反应,证明所获得的mAb均完全针对AsiaI FMDV抗原决定簇。结论:在口蹄疫病毒mAb的研究中,VP1重组蛋白有望代替活病毒来制备mAb。AsiaI口蹄疫病毒VP1mAb的成功制备,为进一步研究和开发新型口蹄疫的检测方法和抗原表位奠定了基础。     

连环恒温扩增技术研究进展

连环恒温扩增技术是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物,利用一种链置换DNA聚合酶在恒温65℃左右保温几十分钟而完成的核酸扩增反应,通过检测反应过程中获得的副产品焦磷酸镁所形成白色沉淀的混浊度来判定扩增结果。由于其具有快速、简便、特异性好、成本低等优点,已经广泛应用于临床诊断、食品卫生检疫及基因芯片的开发;在细菌和病毒的检测方面对临床医学有重要意义。本文就连环恒温扩增的技术原理及其应用作一综述。     

SAT2型口蹄疫病毒南非地区分离株结构蛋白VP1及其C端的表达、纯化和反应原性分析

目的:表达SAT2型口蹄疫病毒结构蛋白VP1及其C端,进行反应原性分析并制备多克隆抗体。方法:以SAT2型口蹄疫病毒南非地区分离株结构蛋白VP1编码区的重组克隆载体为模板,设计特异性引物,扩增VP1基因及其C端编码区,然后将该其分别克隆至原核表达载体pET-30a(+)中,转化大肠杆菌工程菌株BL21(DE3)plysS,经IPTG诱导,以金属离子螯合层析法对表达的VP1、VP1C端融合蛋白进行纯化,经Westernblot对其反应原性进行分析。用纯化的蛋白免疫新西兰大耳白兔制备其多克隆抗体,以ELISA方法测定抗体效价。结果:实现了SAT2型口蹄疫病毒结构蛋白VP1及其C端的高效表达,表达产物主要以包涵体的形式存在。SDS-PAGE显示纯化的目的蛋白分别在相对分子质量35000和19000处有单一目的条带,具有较高的纯度。Westernblot结果显示,纯化的VP1及其C端均可与牛SAT2型FMDV阳性血清反应,而与阴性对照血清无交叉反应。结论:用纯化的VP1及VP1C融合蛋白免疫新西兰大耳白兔制备的多克隆抗体效价达1∶12800以上,具有较高的特异性。     

A型口蹄疫病毒型特异性抗原的可溶性原核表达及多克隆抗体的制备

目的可溶性表达A型口蹄疫病毒型特异性结构蛋白VP1,制备型特异性的兔抗A型FMDV VP1多克隆抗体。方法以A型口蹄疫病毒结构蛋白VP1基因重组克隆载体pGEM-AVP1为模板,设计表达引物,经PCR扩增获得上游带有OmpT信号肽编码序列的VP1基因编码区,将其克隆至该表达载体pET-30a(+)中,构建可溶性原核表达载体pET-30a-OmpT-AVP1。将该重组质粒转化大肠杆菌工程菌株BL21-(DE3)-plysS,经IPTG诱导表达,以金属离子螯合层析法对可溶性表达的VP1融合蛋白进行纯化,然后用纯化的蛋白免疫新西兰大耳白兔制备其多克隆抗体,以ELISA、Western blot和间接免疫荧光法分别对多克隆抗体进行鉴定。结果 SDS-PAGE电泳分析显示pET-30a-OmpT-AVP1重组菌经诱导后表达一Mr约为33 000的VP1融合蛋白,与预期结果相符。目的蛋白纯化后,在电泳图片上显示较为清晰的单一条带。Western blot分析结果显示,VP1蛋白可与豚鼠抗A型口蹄疫病毒阳性血清反应。用纯化VP1蛋白免疫新西兰大耳白兔制备的多克隆抗体效价达1∶12 800以上,具有较高的型特异性,并且可与同型FMDV细胞培养物中的病毒抗原发生反应。结论制备了具有高亲和性和特异性的兔抗A型FMDV结构蛋白VP1多克隆抗体,为A型FMDV易感动物的抗体筛查及病原鉴定奠定了基础。