以Ad-Easy载体系统快速构建PTEN重组腺病毒表达载体

目的 应用Ad-Easy腺病毒载体系统构建携带抑癌基因PTEN的重组腺病毒表达载体.方法 用插入有抑癌基因PTEN和绿色荧光蛋白的穿梭载体pAdTrack-CMV转化已经含有腺病毒骨架载体pAdEasyl的E.coliBJ5183(Ad-1 cells)进行同源重组,获得重组腺病毒质粒,经Pac Ⅰ线性化后,转染293细胞.结果 得到重组腺病毒,转染重组腺病毒DNA的293细胞出现细胞病变,经PCR对传代的Ad-PTEN分析证实得到目的基因,荧光显微镜能观察到293细胞内有绿色荧光.结论 腺病毒Ad-Easy系统是一种较为简便、快速的构建重组腺病毒的好方法,且生成的病毒滴度高、转导效率好,为进一步研究PTEN基因应用于癌症基因治疗提供实验基础.     

携带HGF基因的重组腺病毒表达载体的构建

目的 构建携带肝细胞生长因子HGF的重组腺病毒表达载体。为研究HGF的功能、作用机制及临床应用奠定基础。方法 以pcDNA3.0-HGF为模板,经PCR扩增得到HGF基因,将其插入到带有绿色荧光蛋白基因的穿梭载体pAdTrack-CMV-GFP中,得到重组质粒pAdTrack-CMV-HGF-GFP。将线性化的pAdTrack-CMV-HGF-GFP与pAdEasy-1质粒共转化BJ5183感受态细胞,进行同源重组,得到重组腺病毒质粒,经PacI线性化后,转染AD293细胞。结果 得到重组腺病毒,转染重组腺病毒DNA的AD293细胞经荧光显微镜能观察到AD293细胞内有绿色荧光,且出现细胞病变反应（cytopathic effects,CPE),对传代的Ad-HGF进行PCR分析证实得到目的基因,感染CHL细胞,通过western blotting分析HGF蛋白表达量,从而证实重组腺病毒载体构建成功。结论 腺病毒制备简便,成本低,周期短,毒性小,产量高,感染率及蛋白表达率高,成功构建Ad-HGF为进一步研究HGF并最终使其在临床应用中更为方便提供实验基础。     

Bek腺病毒表达载体的构建及其在哺乳类动物细胞中的表达

目的构建Bek腺病毒表达载体并观察该载体在成纤维细胞中转基因表达FGFR2-Ⅲc的情况,为研究骨骼发育打下基础.方法利用AdEasy-1腺病毒载体系统构建Bek腺病毒表达载体;该载体感染成纤维细胞后,通过荧光定量PCR(FQ-PCR)检测Bek腺病毒表达载体转基因表达FGFR2-Ⅲc mRNA情况.结果Bek腺病毒表达载体感染成纤维细胞后,成纤维细胞有绿色荧光表达,荧光定量PCR检测表明Bek腺病毒表达载体转基因表达FGFR2-Ⅲc mRNA效果明显(P＜0.05).结论Bek腺病毒表达载体构建成功,能够转基因表达FGFR2-Ⅲc mRNA,为研究骨骼发育和成骨机制提供了基础.     

PTEN重组腺病毒载体的构建及其在气道平滑肌细胞的表达

目的 应用pAdxsi载体系统构建携带PTEN基因的腺病毒载体.方法 将PTEN cDNA自载体pcDNA3-PTEN中切出,克隆至穿梭质粒pShuttle-GFP-CMV中,然后与腺病毒质粒pAdxsi在化学感受态细胞DH5α菌株内同源重组,经Pac-Ⅰ线性化后,重组子通过脂质体2000介导转染HEK293细胞,产生有感染能力的腺病毒,并测定其滴度,通过荧光显微镜能观察HEK293细胞内绿色荧光的表达;PCR检测腺病毒载体PTEN mRNA的表达,Western blotting检测PTEN蛋白在气道平滑肌细胞的表达.结果 感染腺病毒载体的HEK293细胞表达GFP随着时间逐渐增强,并且出现明显的细胞病变效应,经过3轮扩增后病毒达到合适的滴度,构建的Ad-PTEN腺病毒滴度为2×1010pfu/ml,PCR扩增后经琼脂糖凝胶电泳证实其表达,Western blotting检测纠腺病毒感染的气道平滑肌细胞内PTEN蛋白表达明显增高.结论 成功构建了携带野生型PTEN腺病毒载体,为进一步研究PTEN基因应用于哮喘治疗提供了实验基础.     

腺病毒载体及其应用

随着疾病分子水平机理研究的不断深入,基因治疗已成为很多疾病防治及医学研究工作新的切入点。理想的基因治疗方案需具备有效性与安全性,因此安全有效的基因转导载体及技术是决定基因治疗成败的关键。在众多的基因转导载体中,重组腺病毒载体能利用病毒自身感染宿主细胞的特点,简便有效地将目的基因导入靶细胞,并使其有效表达。而且腺病毒为DNA病毒,极少发生插入突变,载体操作方便、宿主广泛、容易增殖,并具有携带外源基因容量大,可表达接近翻译后成熟水平蛋白质等特点,已被广泛用于多种疾病的基因治疗。本文拟就腺病毒载体的构建,载体效能…     

重组腺病毒载体在肿瘤基因治疗中的应用

腺病毒载体转导目的基因具有效率高、滴度高、在体内不与宿主细胞染色体整合等优点,使腺病毒载体在肿瘤的基因治疗研究与实践方面得以广泛运用。本文就三代腺病毒载体的构建与改进,腺病毒载体介导的肿瘤基因治疗策略及其应用进展进行了简要地综述,并讨论了在肿瘤基因治疗中仍需解决的安全问题和面临的挑战。     

重组AdPD-L1腺病毒的构建表达及鉴定

目的构建程序性死亡配体-1(PD-L1)重组腺病毒载体,以期用于体内实验研究.方法酶切含有小鼠全长PD-L1 cDNA的pcDNA3.1/PD-L1质粒,亚克隆到穿梭质粒pAdtrack-CMV上,在BJ5183细胞内和AdEasy-1同源重组,筛选阳性克隆,酶切、测序鉴定正确,线性化后脂质体法转染293细胞进行包装、扩增,利用报告基因EGFP对病毒滴度进行监测,氯化铯密度梯度离心纯化病毒.PCR、Western blot鉴定AdPD-L1感染293细胞后PD-L1的表达,同时进行野生型腺病毒的检测和PD-L1在混合淋巴细胞反应中的作用.结果测序、酶切证实PD-L1基因重组腺病毒载体构建成功.RT-PCR、Western blot检测AdPD-L1感染的293细胞,均有PD-L1的表达.无野生型腺病毒的产生,PD-L1能显著抑制小鼠混合淋巴增殖反应.结论成功构建了含小鼠PD-L1基因的重组腺病毒载体,这种膜结合性的PD-L1与其相应受体结合后,对T细胞可起到负性调控的作用,为下一步体内基因治疗实验奠定了基础.     

Vasostatin重组腺病毒的构建和体外表达的研究

目的构建vasostatin重组腺病毒表达载体,并进行体外表达研究。方法根据GenBank中提供的钙网蛋白序列,设计并合成引物,以人骨骼肌cDNA文库为模板用PCR扩增出人vasostatin基因,将其克隆入T载体。经酶切及测序鉴定后亚克隆至穿梭载体,与经过限制酶处理的骨架腺病毒载体DNA—TPC复合物共转染293细胞。用Western blot检测体外表达。结果PCR扩增出约590bp产物,测序结果与文献报道一致。用PCR及Western blot证实重组腺病毒构建成功,能有效的表达出vasostatin蛋白。结论vasostatin重组腺病毒载体能有效的在体外表达出vasostatin蛋白。     

反义BTEB2腺病毒载体的构建及其在血管平滑肌细胞中的表达

目的 :构建反义BTEB2重组腺病毒载体 ,以研究BTEB2反义RNA对血管平滑肌细胞 (VSMC)增殖及动脉再狭窄的影响。　方法 :从培养的大鼠VSMC中提取总RNA ,通过RT PCR制备BTEB2cDNA ,将BTEB2cDNA反向连接至腺病毒穿梭质粒pDC31 5中 ,构建重组穿梭质粒pDC31 5ASBTEB2 ,将其与腺病毒基因组质粒pBHGloxΔE1 ,3Cre共转染 2 93细胞获得重组腺病毒 ,采用PCR方法对其进行鉴定 ;用重组腺病毒感染VSMC ,通过RT PCR检测BTEB2反义RNA在VSMC中的表达。　结果 :在病变 2 93细胞的冻融上清中含有反义BTEB2重组腺病毒 ,其滴度为 5×1 0 9ml。VSMC被重组腺病毒感染后 ,可检测到BTEB2反义RNA的表达。　结论 :成功构建了反义BTEB2重组腺病毒载体 ;重组腺病毒可在VSMC中表达BTEB2反义RNA ,为进一步研究BTEB2反义RNA对VSMC增殖及动脉再狭窄的影响奠定了基础     

小鼠角质化细胞生长因子及其受体的重组腺病毒表达载体的构建

【论文特点介绍】既往研究表明角质化细胞生长因子（KGD对急性起病的ALI／ARDS，以及慢性进展的PF均有预防作用。因此，构建KGF、KGFR的重组腺病毒载体对于探索肺部疾病的治疗，探讨KGF，乃至其他生长因子在肺损伤免疫进程中的作用都是一个有力的工具。     

靶向性治疗EBV阳性淋巴瘤的腺病毒载体的构建及初步鉴定

目的:构建靶向EBV阳性淋巴瘤且携带野生型P53基因的重组腺病毒.方法:构建重组质粒pDC311.orip-CMV.P53.IRES-EGFP,后将该质粒与腺病毒骨架质粒PBHGE3共转染293细胞,包装成rAd5.orip-CMV.P53.PCR方法对病毒鉴定后,TCID50法测定其滴度,同时用该病毒分别感染EBV阳性Raji细胞和EBV阴性Jurket细胞,以观察病毒的特异性.结果:成功地构建了能表达P53靶向EBV阳性淋巴瘤的重组腺病毒,病毒的滴度为3.6×1012pfu/L.体外细胞实验显示该病毒具有一定特异性.结论:成功构建rAd5.orip-CMV.P53载体,为靶向治疗EBV阳性淋巴瘤奠定基础.     

人survivin基因重组腺病毒载体的构建及其在DCs中的表达

目的构建含有人survivin基因的重组腺病毒载体,为转染树突状细胞构建DC疫苗和基因治疗奠定基础.方法自行设计一对分别含有Kpn Ⅰ和Xhol Ⅰ酶切位点的survivin基因上下游引物,以质粒pCITE/survivin为模板,通过PCR扩增获得survivin基因全部序列.片段回收后经酶切,定向插入腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,获得重组质粒pAdTrack-CMV-survivin.通过Kpn Ⅰ和Xhol Ⅰ双酶切、PCR及插入片段测序鉴定后,将正确重组体pAdTrack-survivin转化包含腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183菌.同源重组后用选择性培养基筛选阳性克隆,提取质粒用脂质体介导转染293细胞,通过观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达及PCR扩增目的基因等方法鉴定重组的腺病毒.同时将病毒上清转染树突状细胞,通过观察绿色荧光蛋白的表达以及Western blot分析观察survivin蛋白表达.结果成功构建了含有人survivin基因的重组腺病毒,病毒滴度为1.65×108PFU/ml.在19×103频段附近可见survivin蛋白表达为16.5×103.结论该重组腺病毒载体的构建及成功转染到树突状细胞内表达,为下一步研究人survivin作为靶抗原及基因治疗奠定了基础.     

人IL-24基因重组腺病毒的构建及其在A549细胞中的表达

目的构建含有人IL-24基因的重组腺病毒载体,并转染肺腺癌细胞A549细胞观察其感染能力,为进一步的基因治疗奠定实验基础.方法采用基因工程技术将人IL-24基因cDNA亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,采用PAdEasy系统进行细菌内同源重组,后通过脂质体将正确重组体包裹并转染293T细胞以包装并扩增病毒.采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定, 利用穿梭质粒中所带绿色荧光蛋白GFP报告基因,对病毒滴度和感染效率进行检定;最后采用免疫组化法对IL-24在A549中的表达进行检测.结果酶切和PCR结果证实IL-24基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达1.2×1010 pfu/ml,能够成功转染A549细胞并在其中进行表达.结论成功构建了有较强感染能力的含人IL-24基因的重组腺病毒载体.     

携带内皮抑素基因的重组腺病毒的构建

目的 利用AdEasy-1系统,构建并鉴定人内皮抑素重组腺病毒,为后续的实验奠定基础.方法 以PshuttleEndostatin质粒为模版PCR扩增内皮抑素基因片断,克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV中,再与骨架质粒pAdEasy-1在大肠杆菌BJ5183中同源重组,在AAV293细胞中包装并扩增.结果 重组腺病毒经测序、酶切鉴定正确,病毒滴度为2.06×1010 pfu/ml.结论 人内皮抑素重组腺病毒pAd-Endo构建成功.     

双自杀基因融合基因重组腺病毒的制备与鉴定

目的：制备含胞嘧部氨酶（CD）基因,胸苷激酶（TK）基因的融合基因重组腺病毒,为恶性肿瘤的基因治疗研究作准备。方法：构建包含有CD,TK融合基因的重组粘粒,将其与腺病毒DNA末端肽复合物混合后以磷酸钙共沉淀法转染人胚肾293细胞株细胞,获取重组腺病毒,并进行鉴定。结果：酶切结果及PCR结果显示,重组粘粒中CD,TK融合基因插入正确,经鉴定所获重组腺病毒带有融合基因,并且无具有复制能力的腺病毒存在。结论：所获重组病毒为E1,E3缺陷型,含有所需的双自杀基因,可进一步用于基因治疗研究。     

Construction and identification of recombinant adenovirus vector containing the hVEGF165 gene

Summary To construct the recombinant adenovirus vector containing the cDNA for human vascular endothelial growth factor (hVEGF₁₆₅), the cDNA for hVEGF₁₆₅ was subcloned into pACCMV · pLpA. Subsequently, this recombinant pACCMV · hVEGF was co-transfected into 293 cells together with pJM17 to obtain the replication-deficient recombinant adenovirus containing hVEGF gene — Ad-CMV · hVEGF. The VEGF gene expression was detected by using RT-PCR and Western blot in rabbit aorta vascular smooth muscle cells (VSMC) infected with AdCMV · hVEGF. Cultured human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) were incubated with the conditioned medium (CM) from above mentioned VSMC infected with AdCMV · hVEGF to observe the effect of VEGF on proliferation of HUVEC. 48 h after the infection with AdCMV · hVEGF, VSMC demonstrated VEGF expression, and the expressed VEGF could stimulate the proliferation of HUVECin vitro. Successfully prepared AdCMV · hVEGF₁₆₅ could express biologically active VEGF in infected VSMC, and stimulate proliferation of HUVEC.     

人BMP-7基因重组腺病毒的构建与鉴定

目的 构建含有人骨形态发生蛋白-7(bone morphogenetic protein-7,BMP-7)基因的重组腺病毒载体,并对其相关指标进行鉴定,观察其对肾小管上皮细胞株(HKC)细胞的转染情况.方法 用基因工程技术将人BMP-7基因cDNA亚克隆至穿梭质粒pDC316上,利用脂质体介导的方法将AdMax腺病毒包装系统的骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre和穿梭质粒pDC316-BMP-7转染入HEK293细胞,进行同源重组,得到腺病毒重组质粒Ad5-BMP-7,并在其中包装扩增病毒.采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定,利用穿梭质粒中所带绿色荧光蛋白GFP报告基因,进行病毒滴度的测定和对HKC细胞感染效率的检测.结果 酶切鉴定及PCR结果证明BMP-7基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达1.25 × 1010PFU/ml,对HKC有较强感染能力.结论 应用细胞内同源重组方法成功构建了含人BMP-7基因的重组腺病毒载体.     

人p16基因的重组腺病毒构建及鉴定

目的构建含有人p16基因的重组腺病毒载体,并对其相关指标进行鉴定.方法用基因工程技术将人p16基因cDNA亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,利用PAdEasy系统进行细菌内同源重组,然后通过脂质体将正确重组体包裹并转染293T细胞,并在其中包装扩增病毒.采用PCR方法对重组腺病毒进行鉴定, 利用穿梭质粒中所带绿色荧光蛋白GFP报告基因,对病毒滴度和感染效率进行检测.结果酶切鉴定及PCR结果证明p16基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达6.1×1010pfu/ml,对人成纤维细胞有较强感染能力.结论应用细菌内同源重组方法成功构建了含人p16基因的重组腺病毒载体.