杜氏盐藻葡萄糖-6-磷酸异构酶在真核细胞中的表达

目的:分别构建杜氏盐藻葡萄糖-6-磷酸异构酶(DsGPI)绿色荧光蛋白表达载体和真核表达载体。方法:PCR扩增得到上、下游分别添加EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点的DsGPI基因,双酶切后与绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1连接,得到重组载体pEGFP-C1-DsGPI,转染狗肾细胞MDCK,观察绿色荧光蛋白在细胞中的定位;同理将上、下游分别添加BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点的DsGPI基因与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,得到pcDNA3.1-DsGPI,转染食管癌EC9706细胞,分别应用RT-PCR法和Westernblot法检测DsGPI mRNA和蛋白的表达。结果:DsGPI在MDCK细胞中定位于细胞核,在EC9706细胞中被有效表达。结论:成功构建了DsGPI的绿色荧光蛋白表达载体和真核表达载体。     

杜氏盐藻葡萄糖-6-磷酸异构酶重组蛋白的纯化及其多克隆抗体制备

目的：纯化杜氏盐藻葡萄糖-6-磷酸异构酶（GPI）重组蛋白,制备多克隆抗体。方法：PCR扩增得到两端分别添加NdeⅠ和EcoRⅠ酶切位点的GPI基因,双酶切后插入原核表达载体pET28a（＋）,得到重组载体pET28a-GPI,经鉴定正确后,用该重组载体转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG诱导表达后用镍离子柱纯化目的蛋白并免疫新西兰白兔,间接ELISA和Westernblot法检测抗体的效价和特异性。结果：杜氏盐藻GPI基因在大肠杆菌BL21（DE3）中得到高效表达,占总蛋白的41.6%。以高纯度的目标蛋白作为抗原免疫新西兰白兔,得到抗GPI的抗血清。间接ELISA检测抗血清效价达到1：512000,Westernblot检测证实抗血清能与目的蛋白特异性结合。结论：成功纯化了杜氏盐藻GPI重组蛋白并制备了特异性的GPI多克隆抗体。     

杜氏盐藻14-3-3蛋白cDNA片段的克隆与分析

目的:克隆杜氏盐藻14-3-3蛋白的cDNA片段,并对其进行测序和序列分析.方法:根据衣藻、烟草、豌豆、拟南芥、西红柿等14-3-3蛋白的高度保守序列SVAYKNV、DSTLIMQ设计一对简并引物,采用RT-PCR方法扩增杜氏盐藻14-3-3蛋白的cDNA片段.PCR产物克隆至T载体后转化大肠杆菌JM109,筛选阳性菌落,测序,BLAST进行同源性比对.结果:克隆获得531 bp的cDNA片段,编码177个氨基酸(GenBank AN:AY965896).同源性比较显示,序列与其他生物具有高度的同源性,其与衣藻、烟草、豌豆、拟南芥、西红柿、人等的同源性分别为:94%,84%,84%,83%,83%和80%.结论:克隆得到了杜氏盐藻14-3-3蛋白的cDNA片段.     

用基因枪法将bar基因导入杜氏盐藻及转基因藻株的检测

目的：探讨基因枪转化方法不同轰击条件和启动子的选择对转化杜氏盐藻的影响。方法：以抗除草剂(bar)基因作为报告基因,用基因枪法将其导入杜氏盐藻。通过草丁膦筛选培养获得转化藻株,对转化藻株进行分析。结果：在氦气压力为100L／min条件下,微弹轰击2次比微弹轰击1次或3次的效果都好;杜氏盐藻碳酸酐酶(CA1)基因启动子可驱动bar基因在杜氏盐藻巾瞬时表达,而双拷贝碳酸酐酶(DCA1)基因启动子可驱动bar基因在杜氏盐藻中稳定表达。结论：在氦气压力为100L／min条件下微弹轰击2次,可能是基因枪法转化杜氏盐藻的较好转化条件。在转基因杜氏盐藻研究中,DCA1基因启动子可能是一种较为理想的启动子类型。     

莱茵衣藻叶绿体atpA启动子在杜氏盐藻中转录活性的检测

目的：验证莱茵衣藻叶绿体atpA启动子在杜氏盐藻叶绿体中的转录活性。方法：以绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)为报告基因,将报告基因插入莱茵衣藻叶绿体atpA启动子与rbcL终止子之间,构建载体pSP71-atpA—EGFP,用基因枪法转入杜氏盐藻叶绿体中,通过荧光显微镜观察EGFP基因在atpA启动子控制下的表达,以验证atpA启动子在杜氏盐藻叶绿体中的生物活性。结果：荧光显微镜下观察到：EGFP在杜氏盐藻叶绿体中得到了表达。结论：莱茵衣藻叶绿体atpA启动子在杜氏盐藻叶绿体中有转录起始活性,可以应用于杜氏盐藻的叶绿体转化。     

盐藻cbr基因启动子及其3''''-非翻译区序列的克隆

目的：克隆盐藻cbr基因启动子和3‘-非翻译9(3‘-UTR)片段。方法：设计2对引物，通过2轮巢式PCR反应，扩增cbr基因启动子，其中首轮PCR反应使用改良的降落PCR程序，第二轮巢式PCR反应的模板是第一轮PCR产物，使用普通PCR程序；cbr基因3‘-UTR片段的克隆采用一对引物，通过一般PCR程序得到。结果：通过巢式PCR得到长约1．1kb的cbr基因启动子片段，DNA测序结果表明碱基序列与文献记载完全相同，无任何碱基突变；克隆的长0．3kh的chr基因3‘-UTR片段经人工比较，与收录的序列吻合，无碱基突变。结论：利用普通Taq酶对用PCR方法克隆得到了盐藻胡萝卜素生物合成相天基因cbr的2个基因表达渊控序列；结合使用巢式PCR和改良降落PCR，可以非常有效地克隆具有复杂二级结构的DNA片段；通过两端人工添加的限制序列．将cbr基因启动子和3‘-UTR2个调控片段构建到同一个载体上，形成cbr基因表达盒，为构建转基因盐藻表达载体打下了基础。     

杜氏盐藻基因FLA8原核表达载体的构建和表达

目的:构建杜氏盐藻FLA8原核表达载体。方法:用RT-PCR方法扩增杜氏盐藻FLA8基因的开放阅读框,通过预先添加的酶切位点切割后按正确的顺序插入到经相同酶切割后的原核表达载体pET28a(+)中,转化到大肠杆菌DE3中测序正确后进行原核表达。结果:成功地将FLA8的开放阅读框插入到表达载体中,FLA8在大肠杆菌中的表达主要以包涵体的形式存在,蛋白质的相对分子质量为87000。结论:杜氏盐藻FLA8基因原核表达载体构建成功。     

转染杜氏盐藻14-3-3基因对食管鳞癌EC9706细胞Bcl-2和Caspase-9蛋白表达的影响

目的:探讨转染杜氏盐藻14-3-3基因对食管鳞癌EC9709细胞Bcl-2和Caspase-9蛋白表达的影响.方法:将杜氏盐藻14-3-3基因cDNA序列分别亚克隆入表达载体pEGFP-C1和pcDNA3.1(+)的Hind Ⅲ和Bam H Ⅰ位点,构建真核表达载体pEGFP-C1-14-3-3和pcDNA3.1(+)-14-3-3,采用脂质体方法转染EC9706细胞,同时设立空载体对照和空白对照,荧光显微镜观察pEGFP-14-3-3融合蛋白在EC9709细胞中的定位;G-418筛选稳定转染pcD-NA3.1(+)-14-3-3的细胞株,采用RT-PCR和Western blotting法检测14-3-3基因的表达;Western blotting检测3种细胞中Bcl-2和Caspase-9蛋白的表达.结果:pEGFP-14-3-3融合蛋白定位于EC9706细胞的细胞核;通过G-418筛选,最终获得稳定表达盐藻14-3-3基因的转染细胞株;与转染空载体和空白对照的EC9706细胞相比,转染pcDNA3.1(+)-14-3-3的EC9706细胞中Bcl-2蛋白表达量明显增高[(1.60±0.20)、(0.90±0.15)和(2.40±0.10);F=69.889 7,P＜0.001],而Caspase-9蛋白表达量明显降低[(1.00±0.04)、(1.40±0.08)和(0.40±0.05);F=217.066 7,P＜0.001].结论:杜氏盐藻14-3-3基因可能在EC9706细胞凋亡过程中发挥了抑制作用.     

杜氏盐藻硝酸盐还原酶基因5′上游序列驱动bar基因的表达

目的:探讨杜氏盐藻硝酸盐还原酶(NR)基因5'上游序列(Pnr)是否可以驱动外源基因在杜氏盐藻中的表达.方法:利用改进的重叠区扩增基因拼接法(SOEing),将杜氏盐藻NR基因5'上游序列(Pnr)与除草剂抗性基因bar融合.同时将NR基因3'端序列(Tnr)与克隆载体pEGM-7zf连接,构成中间载体pEGM-7zf-Tnr.最后将融合片段Pnr-Tnr与中间载体连接,构建含Pnr-bar-Tnr表达盒的盐藻真核表达载体p7NBT.电击法转化杜氏盐藻,通过草丁膦培养筛选转化藻株后对其进行分析.结果:转化藻株总RNA的RT-PCR结果扩增出与bar基因序列完全一致的目的片段.结论:杜氏盐藻NR基因Pnr能够驱动外源基因bar的转录.     

盐藻14-3-3蛋白基因原核表达条件的优化

目的探讨盐藻14-3-3蛋白在大肠杆菌BL21中高效表达的条件。方法通过改变诱导剂浓度和诱导时间,用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析不同条件下14-3-3蛋白的表达情况。结果在诱导剂(IPTG)浓度为0.5 mmol.L-1的条件下诱导培养3 h其表达效率最高。结论盐藻14-3-3蛋白在pET原核表达系统中,0.5 mmol.L-1IPTG诱导3 h为其最适表达条件。     

PCR法扩增盐藻叶绿体atpA基因

目的：克隆杜氏盐藻叶绿体atpA基因片段。方法：把GenBank中近10种藻类的atpA全基因的氨基酸序列进行比较,设计简并引物,利用PCR方法从盐藻叶绿体DNA中扩增atpA基因片段,然后胶回收所扩片段并与T—vector相连,转化大肠杆菌JM109,挑阳性克隆鉴定,并测序,再将序列与所选藻类有关序列比较同源性。结果：从盐藻叶绿体基因组中扩增出约400bp的片段。测序结果显示此片段长405bp,推导的氨基酸序列与莱茵衣藻的同源性为920k,,普通小球藻为88％,,原始绿藻为87％,卵形肾藻为86％,Cyanidioschyzon merolae为85％。结论：本实验中所克隆的序列为杜氏盐藻的叶绿体atpA基因片段。     

实时荧光定量聚合酶链反应检测杜氏盐藻突变株中硝酸盐还原酶基因的表达

目的分析获得的2株杜氏盐藻硝酸盐还原酶(NR)突变藻株(M1和M2)中NR基因的表达情况。方法应用实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)方法,以管家基因β-actin作为内参,进行相对定量检测比较NR基因的表达变化。结果盐藻突变藻株NR基因相对表达量明显低于野生型杜氏盐藻。所分离的杜氏盐藻NR突变藻株中确实存在NR基因的突变。结论本研究为最终利用NR基因作为选择标记,建立杜氏盐藻专用筛选标记奠定了实验基础。     

杜氏盐藻硝酸盐还原酶基因5'上游序列的克隆与序列分析

目的:克隆杜氏盐藻硝酸盐还原酶(NR)基因5'上游序列,并对其进行测序和序列分析.方法:提取杜氏盐藻基因组DNA,经过BamH I、EcoR I、Hind Ⅲ、Pst I、Sal Ⅰ及Xbal Ⅰ限制性内切酶分别酶切后,再与相应接头连接,分别构建盐藻步行基因组文库BL、EL、HL、PL、SL和XL.采用巢式(LA)-PCR方法,从上述步行基因组文库中扩增杜氏盐藻NR基因5'上游序列,克隆至pMD18-T,对酶切鉴定正确的克隆进行测序.结果:从HL里扩出约1 200 bp特异性片断,回收此片段并进行T载体克隆,对阳性克隆测序.该序列的3'端与已知NR基因cDNA 5'端序列完全一致.该序列含有多个与转录调控有关的保守序列(如CAAT-box和GAGA-box),含有与EBP、EFII、NF-E1、LV 等转录因子以及广谱激活剂Oct-1结合位点相似的核苷酸序列.结论:采用LA-PCR基因组步行方法,从已知cDNA 周围未知启动子或其他调控区域中克隆得到的NR基因的5'上游区序列,可能是一种新的杜氏盐藻启动子区序列.