人源化抗肝癌scFv融合RC—RNase在大肠埃希菌中的表达及对人肝癌细胞SMMC-7721的体外杀伤作用

目的：在大肠埃希茼中可溶性表达新型重组人源化抗肝癌单链抗体融合RC-RNase(scFv-RC-RNase)，观察其对体外培养的人肝癌细胞SMMC-7721的杀伤作用。方法：将原核表达质粒Tih-scF-RC-RNase以大肠埃希茼E．codiBL21(DE3)为宿主菌，用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导表达．工程菌经超声碎菌、离心后，上清液用Ni-NTA Agarose亲合层析法进行纯化。四甲基噻唑蓝(MTT)法检测纯化蛋白对体外培养的人肝癌细胞SMMC-7721的体外杀伤作用。结果：IPTG诱导5h后，SDS-PAGE显示抗肝癌scFv-RC-RNase在大肠埃希茵E.coliBL21(DE3)中主要以可溶性的形式表达，表达量占茵体总蛋白量的lO．5％。MTT法提示，纯化后的表达产物对体外培养的人肝癌细胞SMMC一7721具有一定的杀伤作用，其半数致死量(LDs50)为0．007g／L。结论：抗肝癌scFv-RC-RNase融合蛋白有望成为一种具有一定临床应用潜力的抗肝癌导向治疗药物。     

牛蛙核糖核酸酶的表达和鉴定及功能检测

目的:在大肠埃希菌中高效表达牛蛙核糖核酸酶(ranacatesbeianaribonuclease,RCRNase),并对其纯化产物进行噻唑蓝(tetrazoliumblue,MTT)实验,观察对肝癌细胞的抑制效果。方法:用异丙基硫代D半乳糖苷(isopropylthioDgalactoride,IPTG)诱导原核表达质粒PET32aRCRNase在大肠埃希菌E.coliBl21(DE3)plysS中表达。菌体经超声、离心后,用NiNTAAgarose亲和层析法对包涵体进行纯化。采用MTT法检测纯化的目的蛋白对体外培养的肝癌细胞的杀伤活性。结果:纯化的目的蛋白经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodiumdodecylsulphatepolyacrylamidegeleletrophoresis,SDSPAGE)蛋白电泳表明,RCRNase在大肠埃希菌中是以包涵体的形式表达。用MTT法的结果中可以看出,纯化的目的蛋白对体外培养的肝癌细胞具有一定的抑制效果,其IC50值(半抑制浓度)是22.44μg/mL。结论:牛蛙核糖核酸酶在大肠埃希菌中得到大量表达,为进一步研究其生物学特性以及功能打下了良好的基础。     

牛蛙核糖核酸酶的表达和鉴定及功能检测

目的：在大肠埃希菌中高效表达牛蛙核糖核酸酶（rana catesbeiana ribonuclease，RC-RNase），并对其纯化产物进行噻唑蓝（tetrazolium blue，MTT）实验，观察对肝癌细胞的抑制效果。方法：用异丙基硫代-D-半乳糖苷（isopropylthio-D-galactoride，IPTG）诱导原核表达质粒PET32a—RC-RNase在大肠埃希菌F．cali B121（DE3）plysS中表达。茴体经超声、离心后，用Ni—NTA Agarose亲和层析法对包涵体进行纯化。采用MTT法检测纯化的目的蛋白对体外培养的肝癌细胞的杀伤活性。结果：纯化的目的蛋白经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium doecyls ulphatepolyacrylamide gel eletrophoresis，SDSPAGE）蛋白电泳表明，RC-RNase在大肠埃希菌中是以包涵体的形式表迭。用MXT法的结果中可以看出，纯化的目的蛋白对体外培养的肝癌细胞具有一定的抑制效果，其IC50值（半抑制浓度）是22．44μg／mL，。结论：牛蛙核糖核酸酶在大肠埃希菌中得到大量表达，为进一步研究其生物学特性以及功能打下了良好的基础。     

抗肝癌单链抗体药剂学改造及其对人类肝癌细胞的体外杀伤实验

目的观察抗肝癌单链抗体经药剂学改造后对体外培养的肝癌细胞SMMC-7721的杀伤作用是否有所提高。方法用IPTG诱导原核表达质粒PET32a—RC—RNase在大肠埃希菌中表达。对包涵体进行复性和纯化，并进行Western—blotting检测。在氯仿中加入磷脂（PC）、胆固醇（CHOL）和胆固醇琥珀酰酯（CHS），除氯仿形成干膜，加入RC—RNase蛋白溶液，充分溶解干膜后，超声、过滤及过Sephadex G-50柱子。测包峰率后加入乙基[3-（二甲胺基）丙基]碳二亚胺盐酸盐（EDC）和氮羟基琥珀酰亚胺磺酸钠（SSNHS），在2-（n-吗啡啉）乙磺酸（MES）缓冲液中反应0．5h，再加入抗肝癌单链抗体（hdscFv），4℃过夜。用MTT（噻唑蓝）法检测所制备的免疫脂质体、细胞毒素和脂质体对肝癌细胞的杀伤作用。结果免疫脂质体对肝癌细胞的杀伤效果最好，细胞毒素次之，脂质体最差，其半抑制浓度值（JC50）分别是：3．28μg／ml、22．44μg／ml和98．26μg／ml。结论经药剂学改造后的抗肝癌单链抗体对体外培养的肝癌细胞杀伤明显提高，为其作为抗肝癌药物的进一步研究打下了基础。     

牛蛙核糖核酸酶在大肠杆菌中的高效表达及其初步纯化

目的:利用大肠杆菌系统表达重组RC蛳RNase融合蛋白,并对其表达产物进行初步纯化。方法:以PCR方法扩增出RC蛳RNase基因,插入到融合蛋白原核表达载体PET32a中,构建重组表达载体PET蛳RC蛳RNase,转化大肠杆菌E.coliBL21(DE3)plyS,利用异丙基硫代蛳β蛳D蛳半乳糖苷(IPTG)诱导表达。工程菌经超声碎菌,离心后,采用Ni亲合层析法在变性条件下进行初步纯化。结果:经IPTG诱导后,SDS蛳PAGE和免疫印迹分析显示,工程菌在相对分子质量为3.1×104处出现一条新生蛋白带,目的蛋白占菌体总蛋白的34%,主要以包涵体形式存在。所得包涵体经纯化,纯度可达90%以上。结论:重组融合蛋白RC蛳RNase在大肠杆菌中获得成功表达,纯化效果令人满意,为进一步研究其生物学特性和功能奠定了良好的基础。     

特异性抗肝癌单链抗体的优化表达与纯化及其生物学活性鉴定

目的:制备有生物活性的特异性抗肝癌单链抗体.方法:以ITPG诱导大肠埃希茵HB2151表达可溶性抗肝癌单链抗体;利用HiTrap抗E Tag亲和层析柱对阳性克隆表达的单链抗体进行纯化;纯化后的单链抗体进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,以Bradford检测法测定其浓度,ELISA法及免疫组化法鉴定其生物学活性.结果:在培养基中加入0.4mol/L蔗糖,以IPTG 1mmol/L于30℃诱导12h,抗肝癌scFv可溶性表达量较多,纯化后可溶性抗肝癌scFv含量为325mg/L,相对分子质量为29×103.与肝癌细胞结合效价为1:64,与肝癌组织结合阳性率为75%,具有良好的生物学活性.结论:成功获得具有生物活性的特异性抗肝癌单链抗体,为肝癌靶向诊断及治疗的开发与应用奠定了基础.     

Stathmin基因反义核酸对人肝癌细胞系的生长抑制作用

目的 :探讨Stathmin基因反义核酸 (AS ODN)对人肝癌细胞系的生长抑制作用。方法 :以高表达Stathmin基因的人肝癌细胞系SMMC 772 1为靶细胞、反义Stathmin (AS ODN)为阻断剂 ,通过RT PCR观察AS ODN对肝癌细胞Stathmin基因表达的抑制 ,MTT试验观察AS ODN对肝癌细胞的生长抑制作用 ,流式细胞仪分析细胞增殖周期的影响。结果 :AS ODN明显抑制了肝癌细胞SMMC 772 1的生长及Stathmin基因的表达 ,P <0 0 5。SMMC 772 1在AS ODN作用下 ,细胞分裂阻滞在分裂期的中期 ,并诱导细胞发生凋亡。结论 :Stathmin基因的反义核酸 (AS ODN)对肝癌细胞的生长可能起十分重要的作用 ,它有望成为肝癌治疗的新靶点     

肿瘤-睾丸抗原LAGE-1基因的原核表达纯化和抗血清制备

目的:构建人肿瘤-睾丸抗原LAGE-1的原核表达质粒,表达、纯化LAGE-1融合蛋白并制备GST-LAGE-1多克隆抗体。方法:逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法扩增人肝癌组织LAGE-1基因3′端片段,连入原核表达载体pGEX-4T-1( ),构建原核表达质粒pGEX-LAGE-1并测序。将该质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3)进行诱导表达,经包涵体透析复性和谷胱甘肽巯基转移酶纯化系统分离纯化目的蛋白。用纯化的融合蛋白GST-LAGE-1免疫新西兰大白兔,间接ELISA法测定抗体效价,饱和硫酸铵沉淀法纯化抗体,并采用Western blot检测GST-LAGE-1多克隆抗体特异性。结果:RT-PCR扩增得到LAGE-1基因3′端264bp片段,测序结果与GenBank公布序列一致;成功构建pGEX-LAGE-1原核表达质粒,含有该质粒的大肠埃希菌经IPTG诱导后表达相对分子质量约为36×103的蛋白,经包涵体复性和GST融合蛋白纯化系统纯化,得到重组蛋白GST-LAGE-1,纯度达90%;制备兔抗GST-LAGE-1抗体,纯化的抗体经Western blot证实可与目的蛋白特异性结合。结论:获得了纯化的肿瘤-睾丸抗原LAGE-1重组蛋白及其特异性多克隆抗体,为进一步研究LAGE-1抗原在肿瘤免疫治疗中的作用奠定基础。     

生长抑素类似物8肽对肝癌细胞增殖的影响

目的 :探讨生长抑素类似物 8肽对人原发性肝癌细胞SMMC 772 1增殖的影响。方法 :运用MTT比色法分析生长抑素类似物 8肽对肝癌细胞生长的影响。结果 :生长抑素类似物 8肽可抑制肝癌细胞SMMC 772 1增殖 ,存在量效和时效关系。结论 :生长抑素类似物 8肽可抑制肝癌细胞SMMC 772 1增殖。     

人肝癌细胞放射敏感性体外研究

 目的　用体外实验方法探讨人肝细胞癌的放射敏感性。方法　三株人肝癌细胞HepG2、SMMC 74 0 2、SMMC 772 1体外培养 ,应用集落形成法和MTT法测定 6MVX线不同剂量照射后细胞的存活率 ,计算三株细胞放射敏感性参数。结果　HepG2的D0 为 1.5 ,SF2 为 0 .4 5 ;74 0 2的D0 为 1.6 ,SF2 为 0 .6 3;770 1的D0 为 1.8,SF2 为 0 .79。MTT法与集落形成法相关性较好 ,r =0 .95 8(P <0 .0 5 )。结论　HepG2具有较高的放射敏感性 ,74 0 2和 772 1的放射敏感性较低 ;MTT法可替代集落形成法作细胞放射敏感性的快速测定。     

双靶向组织特异性HSV-tk/GCV抗瘤系统构建及体外效应研究

目的 构建高靶向性基因转移及基因表达系统,并研究其介导HSV-tk/GCV自杀基因系统对人肝癌细胞的体外杀伤作用。 方法 通过重组DNA技术分别构建anti-TfR ScFv-GAL4融合蛋白表达载体ScFv-GAL4-pET28a及含AFP启动子、GAL4特异性识别序列(GAL4rec)的HSV-tk真核表达载体pEBAF/tk-GAL4rec。前者经IPTG诱导表达获取anti-TfR ScFv-GAL4融合蛋白作为非病毒转运载体,利用受体介导内吞作用介导pEBAF/tk-GAL4rec质粒转染表面均高表达TfR的人肝癌细胞株HepG2、SMMC7721及人肺癌细胞株A549,潮霉素筛选阳性细胞,扩大培养,分别命名为HepG2/tk、SMMC7721/tk及A549/tk,然后通过MTT法检测GCV对它们的杀伤作用。 结果 双酶切鉴定及SDS-PAGE电泳证明非病毒转移载体anti-TfR ScFv-GALA融合蛋白及重组pEBAF/tk-GAL4rec真核表达质粒构建成功。体外杀伤实验中,表面TfR阳性且高分泌AFP(845 ng/ml)的HepG2/tk细胞对GCV很敏感,且抑制率与GCV浓度及作用时间呈正相关;而低分泌AFP(2ng/ml)的SMMC7721/tk细胞对GCV低度敏感;表面TfR阳性但不分泌AFP的A549/tk细胞则对前药不敏感。 结论 双靶向组织特异性HSV-tk/GCV抗瘤系统构建成功,并显示出很好的靶向性。     

双靶向组织特异性HSV-tk/GCV抗瘤系统的构建及体外效应研究

目的：构建高靶向性基因转移及表达系统，并研究其介导HSVtk/GCV自杀基因系统对肝癌细胞的体外杀伤作用。方法： 通过重组技术分别构建antiTfR ScFvGAL4融合蛋白表达载体ScFvGAL4pET28a及含AFP启动子、GAL4特异性识别序列（GAL4rec）的HSVtk真核表达载体pEBAF/tkGAL4rec。IPTG诱导后，利用受体介导内吞作用介导pEBAF/tkGAL4rec质粒转染表面均高表达TfR的人肿瘤细胞株HepG2，SMMC7721及A549。潮霉素筛选后，MTT法检测GCV对它们的杀伤作用。结果：双酶切鉴定、SDSPAGE电泳及测序分别证明antiTfR ScFvGAL4融合蛋白及重组pEBAF/tkGAL4rec真核表达质粒构建成功。体外杀伤实验中，高分泌AFP(845 ng/ml) 的HepG2/tk细胞对GCV很敏感，且抑制率与GCV浓度及作用时间呈正相关；而低分泌AFP(2 ng/ml)的SMMC7721/tk细胞对GCV低度敏感；不分泌AFP 的A549/tk细胞则不敏感。结论：双靶向组织特异性HSVtk/GCV抗瘤系统构建成功，并显示出很好的靶向性。     

HSP70复合物抗人肝癌细胞免疫的初步研究

目的 :研究 HSP70复合物抗人肝癌细胞的免疫效应。方法 :用经 42℃热休克处理的 SMMC- 772 1细胞制备裂解液 ,免疫共沉淀法提取 HPS70复合物 ,采用 SDS- PAGE和 Western- blot鉴定蛋白性质及分子量 ;蛋白测定仪进行复合物定量。 MTT法检测 HSP70复合物体外致敏人脾淋巴细胞对 SMMC- 772 1的细胞毒作用。结果 :SDS- PAGE和 Western- blot证实获得相对分子量约为 7× 10 4的 HSP70蛋白 ;体外细胞毒实施显示在不同效靶比时 ,致敏的淋巴细胞对 SMMC- 772 1均具有一定的杀伤效应 ,且这种效应可被 CD4、CD8的单抗部分阻断。结论 :HSP70复合物能在体外诱导针对人肝癌细胞的淋巴细胞毒效应 ,CD4、CD8介导了部分抗瘤作用 ,提示 HSP70可能通过多种免疫途径参与抗瘤效应。HSP70复合物抗人肝癌免疫的初步研究为今后临床肝癌瘤苗的研制和生物治疗奠定了良好的基础     

表达新城疫病毒HN基因重组鸡痘病毒的构建及其抑瘤作用

目的〖HT5”SS〗： 构建表达新城疫病毒（newcastle disease virus, NDV）HN基因的重组鸡痘病毒vFVHN,探讨vFVHN对体外培养人肝癌细胞 SMMC7721的抑制作用和对小鼠荷肝癌模型的体内抑瘤效果。〖HT5W〗方法〖HT5"SS〗： 以野生型鸡痘病毒（fowl poxvirus, FPV）282 E4株为载体,构建表达新城疫病毒HN基因的重组鸡痘病毒vFVHN。采用5溴2脱氧尿苷（5bromo2deoxyribouridine,BrdU）加压法筛选重组体,并通过RTPCR和Western blot等方法对其进行鉴定。采用噻唑蓝（methylthiazoletetrazolium,MTT）染色法检测vFVHN对人肝癌细胞SMMC7721的杀伤率,并通过检测抑瘤率观察其在C57BL/6小鼠荷肝癌模型的抑瘤效果。〖HT5W〗结果〖HT5"SS〗： 成功构建重组鸡痘病毒vFVHN,其对SMMC7721细胞的杀伤率为43.37%,对C57BL/6小鼠肝癌模型的抑瘤率为20.65%。〖HT5W〗结论〖HT5"SS〗： 重组鸡痘病毒vFVHN可有效杀伤体外培养的人肝癌细胞SMMC7721,并对C57BL/6小鼠荷肝癌模型体内的实体肿瘤有一定抑制作用。     

GST-P12融合蛋白的抗体制备、鉴定及免疫组化分析

目的：为了进一步研究p12DOC-1基因及其蛋白在口腔癌发生中的作用与调控机制,将已表达纯化好的GST-p12融合蛋白进行多克隆抗体的制备及鉴定.方法：将构建好的融合表达载体pGEX-4T-1-DOC-1转化BL21（DE3）型大肠杆菌,用IPTG诱导表达,得到GST-p12融合蛋白,经亲和层析柱纯化后电泳,再割胶研磨作为抗原直接免疫家兔,经Western blot及ELISA检测抗体效价及特异性并做免疫组化分析.结果：得到较高纯度的GST-p12融合蛋白,获得了兔来源的抗p12DOC-1血清,经蛋白免疫印迹杂交反应及免疫组化分析证实所得的抗体具有较高的特异性和效价.结论：成功制备了兔抗人的p12DOC-1抗血清,为进一步研究p12DOC-1在口腔癌中发生缺失的机理打下基础.     

人NY-ESO-1基因的原核表达、纯化和初步应用

目的：克隆人NY-ESO-1基因，进行原核表达和分离纯化，并初步应用于肝癌患者血清NY-ESO-1抗体的检测。方法：通过RT-PCR技术从人肝癌组织中扩增NY-ESO-1基因片段，插入原核表达载体pGEX4T-1( )中，构建重组表达质粒pGEx／ESO1，导入大肠杆菌BL21(DE3)，诱导目的蛋白表达，经包涵体透析复性和GSTrap亲和层析纯化目的蛋白，Westem blot鉴定。应用间接ELISA方法初步检测50例肝癌患者血清和20例正常人血清NY-ESO-1抗体的表达。结果：扩增得到NY-ESO-1基因3′端276bp片段，与GeneBank公布序列一致，构建的pGEX／ESO1原核表达质粒经IPTG诱导，在大肠杆菌中表达分子量约36kD的GST-ESO1融合蛋白，纯化后蛋白纯度为90％。50例肝细胞癌患者血清中4例检测到NY-ESO-1抗体(8％)，正常人血清均为阴性。结论：成功构建pGEX／ESO1重组表达质粒，得到有活性的NY-ESO-1融合蛋白，对肝癌患者血清NY-ESO-1抗体的检测有-定的应用价值。     

重组天花粉蛋白的原核表达、纯化及其对 宫颈癌HeLa细胞增殖的影响

 目的克隆天花粉蛋白(trichosanthin,TCS)的cDNA, 构建原核表达TCS的质粒,从表达菌中分离纯化重组天花粉蛋白（rTCS）后,分析rTCS和nTCS（天然天花粉蛋白）对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响。方法RT-PCR技术从新鲜栝楼叶片中扩增TCS cDNA,测序鉴定后克隆入表达载体pET-28a(+) 并转化入BL21(DE3)细胞。IPTG诱导表达后,用金属镍螯合层析法纯化rTCS蛋白, MTT法分别检测rTCS 和nTCS处理24、48和72h对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响。结果1. 成功克隆获得TCS的cDNA并构建 pET-28a (+)-TCS原核表达质粒;该cDNA的碱基序列与基因库中注册的序列99.4%同源;2.在BL21(DE3)菌中,IPTG可诱导重组TCS蛋白表达,且表达的TCS主要以包含体的形式存在。在一定的时间范围内（0～8h）;rTCS的表达水平与诱导时间正相关;3.用Ni-NTA树脂亲和层析法,从诱导表达菌中获得了高纯度的重组TCS蛋白;4. MTT法分析表明,rTCS和nTCS均对HeLa宫颈癌细胞的生长具有抑制作用。在0～100μg/ml的浓度范围内,随着药物浓度的增加及作用时间的延长,rTCS和nTCS对HeLa细胞的生长抑制率逐渐增大,且各组之间差异有统计学意义（P﹤0.05）;rTCS的IC₅₀小于nTCS。结论本实验克隆了TCS的cDNA,构建了表达载体pET-28a (+)-TCS,并成功地在E.coli中原核表达和纯化出重组TCS蛋白,发现纯化的rTCS和nTCS对HeLa细胞的生长都有明显抑制作用,并且rTCS的细胞毒性小于nTCS。     

抗人大肠癌单链抗体基因的克隆与表达

背景与目的：单链抗体相对于完整抗体具有免疫源性低、对肿瘤组织穿透力强的特点,日益成为肿瘤诊断和治疗的良好导向载体。本研究的目的是将抗人大肠癌单克隆抗体ND－1的重链可变区VH和轻链可变区VL基因借助一短肽序列（Gly4Ser)3进行重组,构建单链抗体基因ND－1scFv,并使其在大肠杆菌中表达。方法：采用RT－PCR技术从能够分泌ND－1单抗的鼠杂交瘤细胞中扩增VH和VL基因,通过重叠延伸拼接PCR在VH和VL基因间引入连接短肽,体外构建ND－lscFv基因,经过常规转化和筛选,将其克隆至PET－28a( )表达载体,由IPTG诱导在大肠杆菌BL21中表达为ND－lscFv与His-Tag的融合蛋白。表达产物用Ni-NTA resin亲和层析方法纯化,并采用ELISA方法检测其免疫活性。结果：序列分析表明,ND－lscFv基因全长732bp,VH354bp位于上游;VL330bp位于下游。SDS－PAGE显示,重组蛋白相对分子量30kDa,与预期结果一致。scFv表达产物以不溶性包涵体形式存在,经亲和层析纯化后蛋白纯度达94％。ELISA结果显示scFv保留了与亲本抗体ND－1相似的免疫活性。结论：成功地构建了抗人大肠癌单链抗体ND－lscFv,并在大肠杆菌中获得了较高水平的功能性表达。