高分辨率熔解曲线分析在大肠癌筛查中的应用

目的 探讨高分辨率熔解曲线分析(high-resolution melting,HRM) 在利用粪便DNA筛查大肠癌中的作用.方法 收集住院治疗的31例大肠癌患者、28例大肠腺瘤患者以及20例来医院体检的正常人新鲜粪便标本,应用HRM法检测粪便中APC、K-ras、p53基因的突变情况.结果 31例大肠癌患者粪便中APC基因突变检出率为41.9%(13/31),K-ras基因突变检出率为35.5%(11/31),p53基因突变检出率为54.8%(17/31),3个基因联合检出率为67.7%(21/31);28例大肠腺瘤患者粪便中APC基因突变检出率为25%(7/28),K-ras基因突变检出率为14.3%(4/28),p53基因突变检出率为46.4%(13/28),3个基因联合检出率为64.3%(18/28);20例正常对照粪便中APC基因突变检出率为5%(1/20),K-ras基因突变率为0(0/20),p53基因突变率为0(0/20).大肠癌组和大肠腺瘤组基因突变检出率均高于正常对照组(P<0.05),而大肠癌和大肠腺瘤组间差异无统计学意义(P>0.05).结论 利用HRM法检测粪便中APC、K-ras和p53基因突变在大肠癌筛查中具有潜在的应用价值.     

粪、血APC及K-ras基因突变联合检测在大肠癌筛查中的作用

目的 通过联合检测粪、血浆中APC和K-ras两种基因的突变,探讨其在大肠癌筛查中的作用.方法 收集本院2003年10月～2004年3月行肠镜检查患者的肝素抗凝血5 ml,大便3～5 g.提取粪便及血浆DNA,采用PCR-SSCP法检测APC和K-ras突变.结果 和结论(1)大肠癌和腺瘤患者血浆APC基因突变分别为41.9%和57.7%(P＞0.05),高于正常对照组(P＜0.05).粪便APC基因突变分别为51.6%和42.3%(P＞0.05),高于正常对照组(P＜0.05).两种检测方法具有高度的吻合度(kappa值为0.811,P＜0.001).(2)血浆K-ras基因突变在大肠癌、腺瘤和正常对照分别为48.4%、3.8%和0%,粪便K-ras基因突变在3组中分别为54.8%、7.7%和11.1%,大肠癌组高于腺瘤组和正常组(P＜0.05),腺瘤组和正常组间无差异(P＞0.05).两种方法检测的吻合度一般(kappa值为0.662,P=0.000).(3)联合检测APC及K-ras基因突变可以提高诊断大肠癌的灵敏度.血、粪联合检测检测APC和K-ras基因突变较粪便检测无明显优势.(4)APC基因突变与是否发生肿瘤区域淋巴结转移有关,K-ras基因突变与病变分化程度有关.     

人粪便K－Ras基因扩增检测对大肠癌诊断和术后随诊的可行性研究

[摘要] 目的 了解大肠癌组织及粪便中K-ras基因的突变状况, 了解粪便中脱落细胞基因检测的可行性及其临床意义。方法 采用PCR-RFLP银深色法检测30例大肠癌患者的手术标本和粪便脱落细胞的K-ras基因第12密码子的突变状况。结果 K-ras第12密码子突变检出敏感性癌组织为70%(21/30), 粪便为60%(18/30)。粪便与相应患者的癌组织检测符合率为90%(27/30)。结论 K-ras基因突变是大肠癌常见的分子事件, 粪便中基因突变检测结果较准确地反映了癌组织突变状况, 对其检测有望成为大肠癌诊断及筛查的无创分子途径。     

人粪便K-ras基因扩增检测对大肠癌诊断和术后随诊的意义探讨

目的 了解大肠癌组织及粪便中K-ras基因的突变状况,了解粪便中脱落细胞基因检测的可行性及其临床意义.方法 采用PCR-RFLP银染色法检测30例大肠癌患者的手术标本和粪便脱落细胞的K-ras基因第12密码子的突变状况.结果 K-ras第12密码子突变检出敏感性癌组织为70%(21/30),粪便为60%(18/30).粪便与相应患者的癌组织检测符合率为90%(27/30).结论 K-ras基因突变是大肠癌常见的分子事件,粪便中基因突变检测结果较准确地反映了癌组织突变状况,对其检测有望成为大肠癌诊断及筛查的无创分子途径.     

不同操作平台、染料间高分辨率熔解曲线分析技术检测烘便基因突变的性能差异

目的 探讨在不同操作平台、染料间高分辨率熔解曲线分析(HRM)技术检测粪便基因突变的性能差异.方法 收集合格的粪便125份,其中大肠癌40份,晚期腺瘤35份,正常对照50份,在LightCycler 480与Rotor-Gene 6000平台设备上,分别使用Resolight或Eva Green染料,检测K-ras基因突变率的差异,所有样品均行测序.结果 测序发现,大肠癌组、晚期腺瘤组、正常对照组K-ras基因突变率分别是40%、31.4%、0%.在LightCycler 480平台,用Resolight/Eva Green染料突变检出率分别为40%/45%、31.4%/34.2%、0%/0%.在Rotor-Gene 6000平台,用Resolight/Eva Green染料突变检出率分别为42.5%/47.5%、34.2%/37.1%、0%/0%.在各组中,不同操作平台、染料间突变检出率差异无统计学意义(P>0.05).HRM检测粪便基因突变敏感度达100%.结论 HRM在不同操作平台、染料间的突变检出率差异无显著性.     

APC、p53、K-ras在结直肠肿瘤检测中的研究价值

目的采用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)银染法检测腺瘤多发性息肉病(APC)、p53、K-ras三个基因在结直肠肿瘤筛查中的敏感性和特异性。方法选择2011年11月至2012年8月惠州市第一人民医院消化门诊收治的14例结直肠癌(CRC组),60例结直肠腺瘤(CRA组),30例正常组粪便标本,提取DNA,PCR-SSCP银染法检测基因突变。结果 APC、p53、K-ras三个基因联合检测在CRC组、CRA组、正常组突变率分别为57.1%(8/14)、30.0%(18/60)、3.3%(1/30);在结直肠肿瘤的灵敏度和特异度分别为35.1%(26/74)、96.7%(29/30),粪便DNA联合检测CRC组、CRA组的检出率高于正常组(均P<0.05)。结论粪便DNA联合检测在无创性筛查结直肠肿瘤中具有可行性,可能是一种适合于结直肠肿瘤筛查的无创性方法和筛查模式。     

APC和β-catenin在大肠癌中的表达及其意义

目的 探讨APC和β-catenin在大肠癌发生、发展中的作用.方法 应用免疫组织化学方法检测30例正常大肠黏膜、30例大肠腺瘤、10例大肠腺瘤恶变及50例大肠癌组织中APC和β-catenin蛋白的表达情况.结果 大肠癌和大肠腺瘤恶变APC阳性率分别为44.0%、40.0%,显著低于大肠腺瘤的86.7%和正常大肠黏膜的100%,差异有统计学意义(P＜0.01).大肠癌、大肠腺瘤恶变和大肠腺瘤β-catenin胞浆/胞核异位表达率分别为62.0%、50.0%、30.0%,显著高于正常大肠黏膜的0%,差异有统计学意义(P＜0.01),大肠癌β-catenin异位表达率显著高于大肠腺瘤,差异有统计学意义(P＜0.01).大肠癌中β-catenin膜表达缺失率为46.0%,显著高于大肠腺瘤(10.0%)和正常大肠黏膜的0%,差异有统计学意义(P＜0.01),且与大肠癌组织分化程度、浸润深度、淋巴结转移、Dukes分期有关.APC蛋白表达与大肠癌组织分化程度有关.大肠癌中β-catenin异位表达与APC阳性表达呈负相关关系(r=-0.39,P＜0.05).结论 APC失表达和/或β-catenin异位表达与大肠癌的发生密切相关,可能是大肠癌发生的早期事件;β-catenin膜表达缺失与大肠癌的侵袭、转移有关.     

人粪便中基因甲基化分析在大肠癌早期筛查中的意义

目的 探讨联合检测粪便中波形蛋白基因、肿瘤抑素受体(OSMR)基因和组织因子途径抑制物2( TFPI2)基因甲基化作为大肠癌早期筛查的可行性和临床意义。方法 收集郑州大学第一附属医院2009年5月至2010年8月收治的60例大肠癌患者、17例大肠腺瘤患者及30名健康对照者的粪便标本,采用甲基化特异性PCR方法 分析其波形蛋白基因,OSMR基因和TFPI2基因甲基化状态。结果 60例大肠癌患者粪便中波形蛋白基因、OSMR基因和TFPI2基因甲基化阳性率分别为53.3％ (32/60),68.3％（41/60）和75.0％ (45/60);17例大肠腺瘤患者3种基因甲基化阳性例数分别为5、7和11例;三者联合检测大肠癌和大肠腺瘤的敏感度分别为86.7％( 52/60)和76.5％(13/17),特异度为86.7％ (26/30)。结论 检测粪便中波形蛋白基因、OSMR基凶和TFPI2基因甲基化在大肠癌诊断和筛查中有潜在的应用价值。     

宁夏地区散发性大肠癌APC基因突变的研究

目的检测宁夏地区散发性大肠癌APC基因的突变情况,探讨本地区APC基因突变与临床病理参数之间的关系。方法运用聚合酶链反应(PCR)和DNA直接测序方法,对58例散发性大肠癌患者癌组织的APC基因第15外显子15-A、15-B、15-C三个区段进行突变检测。结果 58例大肠癌组织中检出25例体细胞突变,突变率为43.1%(25/58),其中P.Val1125Ala、c.3811T>G为新发现的突变位点。该地区散发性大肠癌的APC基因突变在大肠癌各临床病理参数之间的差异均无统计学意义(P﹥0.05)。结论 APC基因突变是宁夏地区散发性大肠癌常见的基因改变事件,以截短型突变为主。腺瘤癌变后APC基因突变与大肠癌的发展和预后无关。     

大肠癌发生发展过程中APC和DCC基因异常改变的研究

目的探讨APC、DCC基因在正常大肠组织、腺瘤及癌组织中的表达情况，分析其相互作用关系，探讨其发病机制，为临床早期诊断和治疗提供实验依据。方法从37例大肠癌、22例大肠腺瘤以及12例正常对照者的大肠组织中分别提取DNA，应用PCR—SSCP法检测组织中APC、DCC基因突变情况。结果37例大肠癌组织中APC基因突变率为37．8％（14／37），DCC基因突变率为51．3％（19／37）；22例大肠腺瘤组织中APC基因突变率为27．3％（6／22），DCC基因突变率为22．7％（5／22）；12例正常组织中APC、DCC基因突变率为0。DCC基因突变与组织分化程度有关，分化程度越低，突变率越高（P〈0．05）。结论APC及DCC基因突变发生在大肠癌的早期阶段，有可能作为早期诊断指标应用于临床。     

结直肠腺瘤，单原发及多原发结直肠癌中P53及K-ras基因的突变分析

【摘要】 目的 探讨结直肠腺瘤、单原发结直肠癌、多原发结直肠癌中P53及K-ras基因的突变。 方法 收集25例正常结直肠组织、38例结直肠腺瘤、78例单原发结直肠癌、19例(同时性多原发癌7例,异时性多原发癌12例)多原发结直肠癌组织标本及患者临床病理资料,提取标本组织中基因组DNA, 直接测序方法进行P53基因外显子5、6、7、8及K-ras基因密码子12、13序列分析,并对结直肠腺瘤及单原发结直肠癌的临床资料与其P53及K-ras基因突变进行多因素相关性分析。 结果 正常结直肠组织、结直肠腺瘤、单原发结直肠癌、多原发结直肠癌中P53基因的突变概率分别是0%(0/25)、44.8%（17/38）、43.6%（34/78）、42.1%（8/19）,K-ras基因的突变概率分别为0%（0/25）、18.4%（7/38）、39.7%（31/78）、47.4%（9/19）,正常结直肠组织中P53和K-ras基因突变概率与结直肠腺瘤、单原发结直肠癌、多原发结直肠癌中突变概率相比,差异均有统计学意义(P<0.05）,结直肠腺瘤中K-ras基因突变概率与单原发结直肠癌、多原发结直肠癌中突变概率相比,差异均有统计学意义(P<0.05）,结直肠腺瘤中P53基因突变概率高于K-ras基因(P<0.05）。P53及K-ras基因在单原发结直肠癌的Ⅰ、Ⅱ期及高分化类型中的突变概率与其在Ⅲ、Ⅳ期及中低分化类型中差异无统计学意义。患者的年龄、性别、家族史、肿瘤位置与结直肠腺瘤及单原发结直肠癌中P53及K-ras基因突变无相关性,肿瘤分期及肿瘤的分化程度亦不是单原发结直肠癌中P53及K-ras基因发生突变的危险因素。 结论 本研究再次证实在结直肠肿瘤的发生和发展过程中,P53及K-ras基因的突变起着重要的作用,并且在结直肠的肿瘤发生发展过程中P53基因的突变可能早于K-ras基因。     

甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析筛查大肠癌的性能评价

目的：评价通过甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析（MS‐HRM）检测粪便中人DNA甲基化筛查大肠癌（CRC）的性能。方法收集合格的新鲜粪便标本82例,其中CRC患者27例（CRC组）、进展期腺瘤（AA）患者25例（AA组）和结肠镜阴性的正常人30例（对照组）,在LightCycler480设备上应用MS‐HRM技术检测上述粪便中vimentin基因的甲基化状态,并与粪便潜血试验（FOBT）的诊断性能相比较。结果MS‐HRM在CRC组、AA组和对照组中检测vimentin基因甲基化的阳性率分别为81．5％（22／27）,80．0％（20／25）和6．7％（2／30）。FOBT在CRC组、AA组和对照组中的阳性率分别为37．0％（10／27）,12．0％（3／25）和3．3％（1／30）。在病例组中,MS‐HRM和FOBT的诊断敏感性分别为80．8％（42／52）和25．0％（13／52）,前者显著高于后者（P＜0．05）;在对照组中两者的诊断特异性分别为93．3％（28／30）和96．7％（29／30）,两者差异无统计学意义（P＞0．05）。结论在CRC筛查中,MS‐HRM技术检测粪便中vimentin基因甲基化状态的诊断性能明显优于FOBT,具有潜在的应用价值。     

大肠癌患者粪便K-ras基因突变的研究

目的:探讨粪便中K_ras基因突变的检测用于大肠癌诊断及筛查的可行性。方法:应用基因扩增_单链构象多态性分析_银染法检测癌组织及粪便中K_ras基因突变。结果:31例大肠癌患者粪便K_ras基因扩增率为70%,癌组织中检测到K_ras突变9例,在相对应患者粪便中检测到突变7例,敏感性77%(7/9),特异性100%。粪便中K_ras基因突变与肿瘤分化程度、Dukes分期、肿瘤部位、粪便隐血试验(Fecal ollult bloodtest FOBT)及癌胚抗原(carcinoembryonic antigen,CEA)无关。结论:粪便中突变基因检测有望成为一种新的大肠癌无创性筛检方法。     

结肠癌K-ras和P~(53)基因序列改变

采用PCR和DNA双链四色荧光单道测序方法对 31例结肠癌组织、13例大肠息肉伴不典型增生、11例结肠癌术后并发腹水标本进行K ras基因外显子 1、2和P53基因外显子 5、6、7、8测序分析。结果显示 :31例癌组织中发现K ras突变 7例 ,P53突变 12例 ,阳性率分别为 2 2 .58%和 38.71% ;13例息肉伴不典型增生组织中发现P53突变 2例 ;11例术后腹水标本中发现K -ras突变 1例 ,P53突变 2例 ,且突变与患者包埋组织结果一致。表明结肠组织癌变与这两个基因突变密切相关 ,癌基因突变是结肠癌较早期的细胞损害 ;DNA测序方法是研究癌基因突变的最精确可靠的方法。     

联合检测粪便中ITGA4和SFRP2基因甲基化在大肠肿瘤诊断和预后中的价值

目的 探讨大肠肿瘤患者粪便中ITGA4和SFRP2基因甲基化水平在其疾病诊断和预后中的价值。方法 实时荧光定量PCR法检测结直肠癌（n=85）、结直肠腺瘤（n=65）和健康人（n=40）粪便中ITGA4和SFRP2基因甲基化水平。结果 3组年龄性别无明显差别,粪便ITGA4和SFRP2基因启动子甲基化在结直肠癌中的阳性检出率分别为48.2%和62.4%,联合检测的阳性检出率81.2%;在结直肠腺瘤中的阳性检出率分别为23.1%和43.1%,联合检测的阳性检出率69.2%。结直肠癌组ITGA4和SFRP2基因启动子甲基化阳性检出率明显高于结直肠腺瘤组（P<0.001,P=0.001）和健康对照组（P均<0.001）,差异有统计学意义。而结直肠癌组术前ITGA4和SFRP2基因启动子甲基化水平与术后是否出现肿瘤复发有关;采用Kaplan-Meier法绘制无复发生存曲线,结果显示ITGA4和SFRP2基因启动子甲基化阳性患者组无复发生存率均明显低于阴性患者组（P=0.0002,P= 0.007）。其他因素均校正的情况下,经COX比例风险回归模型多因素分析,结果显示,术前ITGA4和SFRP2基因启动子甲基化和肿瘤分化程度与结直肠癌的复发有关（P=0.01,P=0.03）,可以作为结直肠癌复发的独立危险因素。结论 基于粪便ITGA4和SFRP2基因甲基化单独检测的阳性检出率较低,而联合检测可以提高结直肠癌的阳性检出率,弥补了单独检测的不足。ITGA4 和SFRP2基因启动子甲基化和肿瘤分化程度可以作为结直肠癌复发的独立危险因素。     

结直肠癌患者不同组织中K-ras基因研究

目的 研究结直肠癌患者不同组织中K-ras基因的临床意义。方法 采用实时荧光定量PCR方法检测患者原发灶组织100例、转移淋巴结组织64例、远处转移灶13例、腺瘤组织19例中K-ras基因突变情况。结果 结直肠癌原发灶、转移淋巴结组织、远处转移灶、腺瘤组织的K-ras基因检出率分别为100%、92.2%、92.3%、89.5%;K-ras基因突变率分别为39.0%、30.5%、33.3%、17.6%。主要突变基因第12编码子34位 G>T, G>A, G>C, 35位 G>A, G>T, G>C;第13编码子 37位 G>C, 38位 G>A等8种基因发生突变。结论 结直肠癌原发灶、转移淋巴结组织、远处转移灶的K-ras基因突变率基本一致, 而腺瘤组织K-ras基因突变率明显低于原发灶、转移淋巴结组织、远处转移灶组织。K-ras基因突变在结直肠癌的发生、发展中起重要作用, 这对结直肠癌的防治有重要的指导意义。     

粪便肠脱落细胞端粒酶活性检测对大肠癌的早期诊断价值

目的探讨粪便肠脱落细胞、组织细胞中端粒酶活性表达对大肠癌早期诊断的意义。方法端粒酶PCR-ELISA检测法检测30例大肠癌患者、30例大肠腺瘤患者及30例对照组健康自愿者粪便肠脱落细胞及对应组织细胞标本中端粒酶活性表达。结果大肠癌组粪便肠脱落细胞标本中,端粒酶阳性表达率为83.3%（25/30）。大肠腺瘤组粪便肠脱落细胞标本中,端粒酶阳性表达率为66.6%（20/30）。对照组粪便肠脱落细胞中端粒酶阳性表达率为3.3%（1/30）。27例大肠癌组织端粒酶表达阳性的患者有25例其对应的粪便肠脱落细胞端粒酶活性也呈阳性表达。结论粪便肠脱落细胞端粒酶活性表达对大肠癌的早期诊断具有重要意义。     

散发性大肠癌多基因突变与肠道内环境因素关系的研究

目的：探讨肠道内环境中因素与散发性大肠癌多基因突变关系。方法：对106例散发性大肠癌患者进行多基因突变和肠道内环境中有关指标(以粪便为标本)的测定，并进行流行病学的病例一病例研究分析。结果：106例散发性大肠癌患者中APC(MCR)，K—raS(12／13)及P53(5／6，7，8)突变率分别为31．19％(32／106)，37．74％(40／106)及39．62％(42／106)。散发性大肠癌患者p53 249密码子突变占p53总突变的42．86％(18／42)；肠道内粪胆汁酸(OR=1．9280，P=0．0052)，Mg^2^ (OR=0．287l，P=0．0121)和Ca^2^ (OR=O．0659，P=O．0307)进入多因素logistic模型；吸烟指数和肠道内胆汁酸与p53 249密码子突变相关。结论：散发性大肠癌确实普遍存在有多种基因的突变，肠道内高胆汁酸可能是散发性大肠癌相关基因突变的重要危险因素，肠道内ca^2^ 和Mg^2^ 可能为保护性因素；广东地区散发性大肠癌p53基因突变有一定特点，有必要探索AFB1在广东地区散发性大肠癌发生发展中可能作用。     

联合检测胸水细胞p53、p16和K-ras基因突变对于肺癌的诊断价值

目的:研究胸水细胞p53、p16和K-ras基因突变及三者联合检测对肺癌的诊断价值。方法:研究组为54例伴有恶性胸水的肺癌患者,对照组为28例出现胸水的结核性胸膜炎和其他胸膜炎患者。常规抽取胸水,提取胸水细胞DNA,采用PCR-SSCP方法,分别对p16基因和K-ras基因的第1、2外显子以及对p53基因第7、8外显子进行突变分析。结果:研究组p16基因突变率为33.3%,而对照组只有7.1%,明显低于肺癌患者,差异有统计学意义(P<0.05);研究组K-ras基因突变率(31.5%)也明显高于对照组(3.7%),差异有统计学意义(P<0.05);研究组p53基因突变率为40.7%,而对照组只有7.1%,明显低于肺癌患者,差异有统计学意义(P<0.05)。联合应用p53、p16和K-ras基因突变检测可将胸水细胞中肺癌阳性检出率提高至70.4%。结论:p53、p16和K-ras基因突变对良恶性胸水鉴别诊断具有重要价值,三者联合应用可提高肺癌的诊断率。