IL-12协同B7-1转基因细胞增强C57BL/6小鼠的抗肿瘤免疫

目的：应用逆转录病毒构建IL－12、B7－1表达载体,以研究基因修饰的肿瘤细胞的癌疫苗作用。方法：将两种表达载体分别转染EL－4胸腺瘤细胞,使该细胞能表达分泌B7－1或IL－12,并研究了该基因导入细胞的抗肿瘤免疫效果。结果：当接种了EL－4／IL－12转染细胞后,在C57BL／6同系鼠中其基因导入细胞的肿瘤原性比较EL－4／Wt和EL－4／Neo组明显减少（P＜0．01）,在EL－4／IL－12组的肿瘤被排斥后,实验动物体内诱发了抗EL－4／Wt的全身性、保护性免疫,用51Cr释放测定法证明有一个较强的抗EL－4／Wt和一个较弱的抗同系Lewis肿瘤细胞的CTL活性,体内淋巴细胞消除分析的结果提示减少的肿瘤原性主要与CD4＋、CD8＋和NK细胞有关。用EL－4／IL－12基因转染的瘤细胞进行疫苗治疗比较用EL－4／Neo瘤细胞作疫苗治疗能更加有效地延缓已建立的EL－4／Wt肿瘤的生长（P＜0．005）,EL－4／IL－12和EL－4／B7－1基因联合转染组比用单一的转基因细胞增强了治疗效果（P＜0．005）。结论：研究结果提示应用IL－12进行血液肿瘤的治疗是有效的,IL－12和B7－1联合使用在未来人类癌症的治疗中有一定的应用前景。     

IL—12协同B7—1转基因细胞增强C57BL／6小鼠的抗肿瘤免疫

目的应用逆转录病毒构建IL-12、B7-1表达载体,以研究基因修饰的肿瘤细胞的癌疫苗作用.方法将两种表达载体分别转染EL-4胸腺瘤细胞,使该细胞能表达分泌B7-1或IL-12,并研究了该基因导入细胞的抗肿瘤免疫效果.结果当接种了EL-4/IL-12转染细胞后,在C57BL/6同系鼠中其基因导入细胞的肿瘤原性比较EL-4/Wt和EL-4/Neo组明显减少(P＜0.01),在EL-4/IL-12组的肿瘤被排斥后,实验动物体内诱发了抗EL-4/Wt的全身性、保护性免疫,用51Cr释放测定法证明有一个较强的抗EL-4/Wt和一个较弱的抗同系Lewis肿瘤细胞的CTL活性,体内淋巴细胞消除分析的结果提示减少的肿瘤原性主要与CD4+、CD8+和NK细胞有关.用EL-4/IL-12基因转染的瘤细胞进行疫苗治疗比较用EL-4/Neo瘤细胞作疫苗治疗能更加有效地延缓已建立的EL-4/Wt肿瘤的生长(P＜0.005),EL-4/IL-12和EL-4/B7-1基因联合转染组比用单一的转基因细胞增强了治疗效果(P＜0.005).结论研究结果提示应用IL-12进行血液肿瘤的治疗是有效的,IL-12和B7-1联合使用在未来人类癌症的治疗中有一定的应用前景.     

IL-12协同B7-1转基因细胞增强C57BL/6小鼠的抗肿瘤免疫

目的:应用逆转录病毒构建IL-12、B7-1表达载体,以研究基因修饰的肿瘤细胞的癌疫苗作用.方法:将两种表达载体分别转染EL-4胸腺瘤细胞,使该细胞能表达分泌B7-1或IL-12,并研究了该基因导入细胞的抗肿瘤免疫效果.结果当接种了EL-4/IL-12转染细胞后,在C57BL/6同系鼠中其基因导入细胞的肿瘤原性比较EL-4/Wt和EL-4/Neo组明显减少(P＜0.01),在EL-4/IL-12组的肿瘤被排斥后,实验动物体内诱发了抗EL-4/Wt的全身性、保护性免疫,用51Cr释放测定法证明有一个较强的抗EL-4/Wt和一个较弱的抗同系Lewis肿瘤细胞的CTL活性,体内淋巴细胞消除分析的结果提示减少的肿瘤原性主要与CD4+、CD8+和NK细胞有关.用EL-4/IL-12基因转染的瘤细胞进行疫苗治疗比较用EL-4/Neo瘤细胞作疫苗治疗能更加有效地延缓已建立的EL-4/Wt肿瘤的生长(P＜0.005),EL-4/IL-12和EL-4/B7-1基因联合转染组比用单一的转基因细胞增强了治疗效果(P＜0.005).结论:研究结果提示应用IL-12进行血液肿瘤的治疗是有效的,IL-12和B7-1联合使用在未来人类癌症的治疗中有一定的应用前景.     

IL-18基因转染人乳腺癌细胞系的建立及其表达的研究

目的　建立转人白细胞介素 -18(h IL -18)基因的乳腺癌细胞株 ,并研究 h IL -18的表达情况。方法　将携带人白细胞介素 -18的质粒 pc DNA3 .1-h IL -18转导入人乳腺癌细胞系 Bcap3 7中 ,通过药物 G-418进行筛选 ,利用 RT-PCR和 EL ISA法对白细胞介素 -18(IL-18)的表达进行检测。结果　 IL-18基因成功地转导入 Bcap3 7细胞中并能顺利表达。RT-PCR电泳结果显示 IL -18基因在 m RNA水平有表达 ;EL ISA结果显示 ,10 6个转导细胞在 2 4小时内分泌 IL-18的含量为 (186.3± 15.7) pg;空载体转染的细胞未检测到 IL-18。结论　人 IL-18基因成功地整合到乳腺癌细胞系 Bcap3 7细胞基因组中 ,且能持续大量表达     

白细胞介素—2（IL—2）基因导入肿瘤浸润淋巴细胞的研究

肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)在体外和IL—2共同培养后能够识别和特异到达肿瘤局部并具有直接杀伤肿瘤细胞的作用。因而我们选择TIL作为抗肿瘤基因治疗的有效载体。Rosenberg组利用逆转录病毒将Neo基因导入人TIL中并回输入体,证明了使用逆转录病毒将基因转移至淋巴细胞在人肿瘤基因治疗中的可行性和安全性。我们将IL—2基因重组至NIH确认的逆转录病毒pN2载体中,经PA317细胞包装后感染人TIL,经G418筛选,成功地获得了导入并表达外源基因IL—2的TIL。     

白细胞介素-18转导人大肠癌细胞株的建立及其生物学活性的研究

目的 :建立转白细胞介素 18(IL 18)基因人大肠癌细胞株 ,并研究IL 18的表达情况。方法 :将携带人白细胞介素 18的质粒pcDNA3 1 hIL 18转染到人大肠癌细胞系SW 4 80中 ,通过药物GENETI CIN(G 4 18Sulfate)进行筛选 ,利用PCR、RT PCR及ELSIA法对IL 18的表达进行检测。结果 :IL 18基因成功的转导入SW 4 80细胞中 ,10 6个转染细胞在 2 4h内分泌IL 18的含量是 112 9± 17 6pg ;空载体转染的细胞和未转染的SW 4 80细胞不产生IL 18。结论 :人IL 18基因成功的整合到大肠癌细胞系SW 4 80细胞基因组中 ,且能持续大量表达     

不同剂量电离辐射对EL—4细胞周期的影响

EL—4细胞系是由9,10—二甲基—1,2—苯并蒽(9,10—dimethyl—1,2—ben—zanzhracene)在C57BL/6N小鼠中诱导的淋巴瘤细胞。在肿瘤药敏和辐射效应的研究中常用EL—4细胞为研究对象,其细胞周期与肿瘤的发生、发展和浸润密切相关。本实验以Pro-     

GM—CSF基因修饰的肿瘤细胞疫苗对荷瘤小鼠的抗肿瘤作用

目的研究GM-CSF基因修饰的肿瘤细胞作为瘤苗的可行性.方法通过逆转录病毒载体,将小鼠GM-CSF基因导入EL-4淋巴瘤细胞中,研究EL-4/GM-CSF在同系C57BL/6小鼠中的成瘤性及其诱导抗肿瘤免疫的效果.结果EL-4/GM-CSF细胞在小鼠中的成瘤性下降,50%小鼠无瘤生存.射线灭活的EL-4/GM-CSF瘤苗能有效地保护野生型肿瘤细胞的攻击,在肿瘤生长的早期对实验性荷瘤小鼠进行治疗,能延长荷瘤宿主的存活时间(33.1±1.8)与对照组EL-4/Wt(23.2±1.5天)比差异有显著性(P＜0.01).基因修饰的瘤苗作用明显增强.结论GM-CSF基因修饰的肿瘤疫苗可诱导较强的抗肿瘤免疫反应,导致肿瘤的部分根除,本实验为基因修饰的肿瘤疫苗的临床应用提出了一定的实验依据.     

IL-24基因对大鼠胶质瘤细胞生长状况的影响

目的　探讨IL 2 4基因对C6大鼠胶质瘤细胞生长状况的影响。方法　应用逆转录病毒载体 ,将IL 2 4基因导入C6细胞 ,经G4 18筛选后获得表达IL 2 4分子的阳性细胞克隆C6 /IL 2 4 ;用RT PCR方法检测目的基因表达 ;四甲基偶氮唑蓝 (MTT)法检测细胞体外增殖状况 ,流式细胞技术检测细胞的增殖活性 ,并制作荷瘤动物模型 ,观察C6 /IL 2 4和C6细胞的体内致瘤性。结果　RT PCR检测表明 ,外源IL 2 4基因于mRNA水平在C6 /IL 2 4细胞已获得稳定表达。C6 /IL 2 4细胞系的体外增殖性较亲代C6细胞明显下降 ,流式细胞术检测其细胞增殖指数 (PI)为 (2 9.71± 0 .89) %。 9只接种C6 /IL 2 4细胞的实验组大鼠中 ,6只颅内成瘤 ,肿瘤体积为 (14 .0 8± 9.81)mm3 ,明显小于接种C6细胞大鼠的肿瘤体积 (P <0 .0 5 )。结论　外源性IL 2 4基因可部分抑制胶质瘤细胞异常增殖的肿瘤特性。     

IL-24对B16细胞生长抑制作用的体内外实验研究

目的:构建白细胞介素24(Interleukin24,IL24)真核表达质粒,研究其体内外表达对肿瘤细胞的生长抑制作用。方法:采用重组DNA技术构建IL24真核表达质粒pEGFPIL24。用脂质体法将重组质粒及空载体体外转染B16细胞,再经激光扫描共聚焦显微镜(LSM)观察其表达,用MTT法检测B16细胞的体外增殖能力,用流式细胞仪检测细胞周期。小鼠实体瘤模型研究基因转染对肿瘤的体内生长抑制作用。结果:pEGFPIL24转染B16细胞后,LSM可观察到IL24在细胞中的表达。转染IL24基因的B16细胞体外增殖能力明显受到抑制,细胞被阻滞在G2/M期。与对照组相比,IL24基因治疗组肿瘤在体内的生长受到明显抑制,P<0.05。结论:IL24基因转染的肿瘤细胞体外生长受抑。于荷瘤小鼠的瘤内注射pEGFPIL24可抑制肿瘤生长,提示IL24具有明显的体内外抗肿瘤作用。     

肿瘤靶向DNA载体--转铁蛋白-多聚乙烯亚胺体外介导小鼠IL-12基因转染小鼠骨肉瘤细胞的实验研究

目的 评价转铁蛋白-多聚乙烯亚胺(Transferrin-polyethylenimine，Tf-PEI)靶向性转染小鼠骨肉瘤细胞的可行性。以Tf-PEI为载体，将小鼠IL-12基因导入小鼠骨肉瘤细胞。方法 以Tf-PEI为载体，将荧光素酶基因和小鼠IL-12基因分别导入小鼠骨肉瘤细胞，并检测其转染效率。以游离转铁蛋白竞争性拮抗Tf-PEI，并观察其对转染效率的影响。结果 Tf-PEI可以高效的、靶向性的转染小鼠骨肉瘤细胞。当N/P比值为5时，Tf-PEI的转染效率最高。游离转铁蛋白能够显著的拮抗Tf-PEI的转染。Tf-PEI还可以成功地将小鼠IL-12基因导入小鼠骨肉瘤细胞。结论 Tf-PEI是一种高效、低毒、肿瘤靶向性的基因转染载体，它能成功地将mlL-12基因导入骨肉瘤细胞，广泛应用于体内外恶性肿瘤基因治疗的实验。     

腺病毒介导的人GM——CSF基因转染瘤苗体内致瘤性降低的实验研究

目的:建立以腺病毒为载体的GM—CSF基因转染瘤苗,并对其体内抗肿瘤作用加以研究。方法:应用携带有人GM—CSF基因的重组腺病毒(R—Ad_5)载体转染BALB/C小鼠肝癌细胞株(H_(22)),体外应用酶联免疫吸附试验(ELISA法)检测GM—CSF表达水平,以GM—CSF基因转染的H_(22)细胞进行致瘤性研究。结果:(1)重组腺病毒载体能成功地介导GM—CSF基因转染H_(22)细胞并能持续有效表达26～31天,瘤苗的辐照处理并不明显影响GM—CSF表达水平。(2)GM—CSF基因转染瘤苗体内致瘤性显著降低。结论:该结果揭示了应用GM—CSF基因转染瘤苗进行肿瘤基因治疗的可行性,为进一步研究肿瘤的GM—CSF基因治疗打下了基础。     

分泌型人白细胞介素18重组质粒的构建及其真核表达

目的：构建带IL—12 P40信号肽序列的分泌型IL—18质粒，使其在真核细胞中稳定表达。方法：根据IL—12 P40的信号肽cDNA序列及人成熟IL—18序列设计4条特异性引物，用RT—PCR法自人树突状细胞中分别扩增IL—12 P40信号肽序列(片段A)及成熟IL—18基因(片段B)，用重叠延伸PCR法拼接和扩增融合基因(片段C)，连接制备pGEM—T克隆载体，亚克隆至pcDNA3．1^ 。转染NCI—H460人肺癌细胞株，经RT—PCR和Western blot检测IL—18的表达。结果：表达质粒的酶切图谱符合预期的结果，测序结果与预期的cDNA序列完全一致，转染细胞株表达了IL—18。结论：成功地构建了含IL—12 P40信号肽序列的IL—18表达质粒，并在人肺癌细胞株中得到了表达。     

阳离子脂质体介导的小鼠白细胞介素2基因修饰肝癌细胞瘤苗

目的 研究阳离了脂质体介导的小鼠白细胞介素2基因修饰肝癌细胞瘤苗的抗肿瘤作用。方法 利用阳离子脂质体Transfectam,将携带小鼠白细胞介素2（IL－2）基因的真核表达南粒VR1110,导入小鼠肝癌细胞H22;采用酶联免疫吸附测定法（ELISA）检测转染后经放射线照射、末经放射线照射和冻融后的细胞培养上清液中白细胞介素2的浓度;并研究转染后经放射线照射而制成的瘤苗的抗肿瘤效应。结果 转染后经放射线照射和末经放射线照射的H22细胞均持续分泌IL－2达30天以上;转染细胞在冻融后也能分泌IL－2;制备的瘤苗对小鼠肝癌模型肿瘤的生长有明显的抑制作用,并能明显提高荷瘤小鼠的生存率。结论 阳离了脂质体介导的小鼠细胞介素2基因转染后,能在肝癌细胞中有效表达,所制备的瘤苗可诱导有效的抗肿瘤效应。     

LRRC4基因表达能降低胶质母细胞瘤细胞系U251的生长和成瘤潜能

背景与目的：LRRC4是作者最近克隆的一个新基因,该基因在原发性脑肿瘤活检标本中明显表达下调。本研究旨在研究LRRC4基因是否具有抑制脑肿瘤生长的能力。方法：LRRC4基因的全长编码区被亚克隆至表达载体pcDNA3．1中,应用脂质体转染的方法将重组的质粒载体导入胶质母细胞瘤细胞系U251,经G418筛选,建立稳定表达LRRC4基因的U251的细胞系。采用细胞增殖实验、软琼脂实验、肿瘤形成实验来考察LRRC4基因表达对于细胞生长和肿瘤形成的影响。结果：经过脂质体转染和筛选,建立了稳定表达LRRC4全长编码区的U251细胞系,用于进一步实验。比较未转染组和转染空白载体组,Northern blot实验证实转染了LRRC4基因的细胞LRRC4 mRNA的表达增强。细胞增殖一定时间后,转染LRRC4基因的细胞较未转染细胞的生长速度明显减慢,克隆形成率明显降低。将这些细胞注射入无胸腺裸鼠体内,40天后处死裸鼠,测量肿瘤大小,结果显示,转染LRRC4基因的细胞形成的肿瘤明显小于对照组。结论：LRRC4基因可转染于人脑胶质母细胞瘤细胞系U251。LRRC4在U251细胞的表达有抑制瘤细胞增殖和抑制裸鼠移植瘤的形成和生长的作用。     

肿瘤靶向性载体介导的IL-12 基因增强裸鼠抗骨肉瘤免疫

 目的 观察以转铁蛋白-多聚乙烯亚胺(Transferrin-polyethylenimine，Tf-PEI)为靶向性载体，体内转染小鼠白细胞介素12(murine interleukin-12，mIL-12)基因，治疗裸鼠骨肉瘤模型的疗效。方法 以Tf-PEI为载体，体外转染mIL-12基因入人骨肉瘤细胞，并以游离转铁蛋白竞争性拮抗Tf-PEI，观察基因表达情况。将Tf-PEI包裹mIL-12基因直接注入荷瘤裸鼠的肿瘤局部，检测此基因在肿瘤细胞中的表达情况和小鼠脾脏自然杀伤细胞(NK)活性。结果 Tf-PEI可以靶向性的将mIL-12基因导入人骨肉瘤细胞。在Tf-PEI／DNA治疗组小鼠的肿瘤局部，mIL-12蛋白水平明显升高，小鼠脾细胞NK活性增强。结论 Tf-PEI是一种高效率的肿瘤靶向性基因转染载体，它可以成功的将mIL-12基因导入裸鼠骨肉瘤模型，mIL-12基因治疗可提高机体的抗肿瘤免疫应答。     

转GM-CSF基因瘤苗联合IL-12治疗T细胞淋巴瘤的实验研究

目的　探讨用转粒细胞巨噬细胞 集落刺激因子 (GM CSF)基因瘤苗 ,联合白介素 12 (IL 12 )治疗小鼠T细胞淋巴瘤的方法。方法　将小鼠GM CSF真核表达质粒 ,用电穿孔法导入小鼠T细胞淋巴瘤细胞系RMA ,有限稀释法制备单个细胞克隆 ,经RT PCR、骨髓祖细胞增殖实验和集落形成实验 ,筛选相对高表达GM CSF的RMA克隆 ,该克隆细胞用丝裂霉素灭活后免疫小鼠 ,以诱导产生抵抗RMA肿瘤细胞再攻击的能力 ,并观察其与IL 12联合应用对淋巴瘤的治疗作用。结果　获得了高表达GM CSF的小鼠T细胞淋巴瘤克隆 ,其动物体内致瘤活性降低 ,将其用丝裂霉素灭活后作为瘤苗可使小鼠产生抗肿瘤的免疫保护力 ,与IL 12联合应用增强其抗肿瘤活性。结论　转GM CSF基因瘤苗可作为有效的抗肿瘤瘤苗 ,与IL 12联合应用较其单独应用更为有效     

白细胞介素12及白细胞介素2对大鼠肝癌的联合基因治疗研究

目的：研究利用小鼠白细胞介素12(mIL12)和人白细胞介素2(hIL2)基因对大鼠肝癌进行联合基因治疗的可行性和疗效。方法：构建携带mIL12和hIL2基因的逆转录病毒载体，转染包装细胞后对实验性肝癌大鼠进行肝癌局部注射，观察对肝癌细胞的生长抑制作用及其对大鼠的免疫功能变化、毒性反应。结果：携带mIL12/hIL2基因的重组逆转录病毒在肿瘤内局部注射明显抑制了肝肿瘤的生长。肝癌接种后第1,3,5,7天治疗组大鼠35 d生存率分别为100%,100%,30%,10%。IL12+IL2治疗组平均生存时间明显高于生理盐水对照组（P＜0.01)、逆转录病毒空载体对照组（P＜0.01)、IL2治疗组（P＜0.01)和IL12治疗组（P＜0.05)。治疗后肝癌组织中浸润的淋巴细胞明显增多。结论：肝癌局部注射携带mIL12和hIL2基因的逆转录包装细胞株可明显抑制肝癌细胞的生长，早期治疗优于晚期治疗。     

烷化剂耐药基因真核表达质粒的构建及在K562细胞中的表达

目的克隆烷化剂耐药基因MGMT，构建真核表达质粒并导入真核细胞进行表达，筛选稳定表达的细胞系。方法从人肝组织中克隆MGMT基因后重组构建真核表达粒质pIRES2-MGMT—EGFP并鉴定。通过脂质体法将目的基因导入K562细胞，应用RT—PCR及Western blot检测目的基因的表达并筛选稳定转染的细胞克隆。结果成功克隆MGMT并构建了真核表达质粒pIRES2-MGMT—EGFP。转染细胞后MGMT在mRNA及蛋白水平均有表达，而对照组则为阴性。结论含烷化剂耐药基因MGMT真核表达质粒的构建及转染后表达的成功为烷化剂耐药基因的相关研究奠定了良好的基础。     

转IL—2基因对人肺腺癌细胞药物敏感性的影响

目的 研究转IL—2基因对人肺腺癌细胞(SPC—A_1)药物敏感性的影响。方法 用MTT法检测阿霉素(ADM)、丝裂霉素C(MMC)、顺铂(DDP)、5—氟脲嘧啶(5—Fu)对导入IL—2基因的肺腺癌细胞株(SPC—A_1/IL—2)的杀伤率,并与未转染IL—2基因的人肺腺癌细胞株(SPC—A_1)比较。结果 ADM、MMC、DDP、5—Fu对SPC—A1/IL—2的杀伤率均高于SPC—A_1,但ADM、MMC、DDP对SPC—A_1/IL—2的半数致死量(LD_(50))与其对SPC—A_1的LD_(50)比较,没有统计学意义(t′=0.175,P>0.05)。而5>Fu对SPC—A_1/IL—2的LD_(50)为23.50±3.04μg/ml,对SPC—A_1的LD_(50)则为39.47±4.01μg/ml,两组LD_(50)比较差异显著(t′=10.58,P<0.001)。结论 转IL—2基因的人肺腺癌细胞对ADM、MMC、DDP的敏感性没有改变,但增加了对5—Fu的敏感性。