透明颤菌血红蛋白基因(vgb)在那西肽产生菌—活跃链霉菌中的表达

目的将透明颤菌血红蛋白基因(vgb)整合到那西肽产生菌—活跃链霉菌(Streptomyces actuo-sus)的染色体上进行表达,从而提高菌体对溶解氧的利用,提高那西肽的发酵产量。方法采用分子生物学方法构建了携带vgb的重组质粒pZV02,采用接合转移的方法将其导入那西肽产生菌—活跃链霉菌中,采用抗生素抗性标记筛选法获得了基因重组菌株。结果在低溶氧的发酵条件下,重组菌株的那西肽产量显著高于对照菌株。结论 vgb在活跃链霉菌中的表达,可以改善菌体对溶解氧的利用,在低溶氧的条件下可以提高发酵产物那西肽的产量。     

透明颤菌血红蛋白基因在红色糖多孢菌株中表达及对红霉素产量的影响

目的利用已含有血红蛋白基因(vgb)的红色糖多孢基因工程重组菌,探讨vgb表达产物对重组糖多孢红霉菌提高红霉素产率的影响。方法用SDS-PAGE、Western blot方法鉴定血红蛋白,用葡萄糖浓度与总蛋白质含量比较原始菌株与重组菌株的差别。结果红色糖多孢基因工程重组菌与原始菌株比较,重组菌株发酵过程葡萄糖浓度的变化出现在第二时段(约38h),原始菌株达到了0.4g/L,而重组菌株只有0.25g/L;第三时段原始菌株出现了游离葡萄糖浓度高峰而重组菌株未出现。在两个菌株中生物物质浓度[以总蛋白质(g/L)表示]存在不同,重组菌株比原始菌株约低27%。红霉素效价,原始菌株和重组菌株分别为3.98和5.15g/L,相当于重组菌株提高红霉素体积产率约29%。结论重组红色糖多孢菌表达了透明颤菌血红蛋白,提高了红霉素产率,对解决抗生素工业和基因工程菌高密度发酵有良好的应用前景。     

活跃链霉菌nshA基因失活对那西肽发酵的影响

目的通过对活跃链霉菌那西肽生物合成基因簇中的nshA基因进行内部片段缺失,考察其对那西肽生物合成的影响。方法利用重叠延伸PCR(Gene splicing by overlap extension PCR,SOE-PCR)的方法失活nshA基因,并构建具有接合转移功能的大肠杆菌-链霉菌重组质粒pSH03,通过接合转移将重组质粒pSH03导入到活跃链霉菌细胞内,并通过同源交换形成活跃链霉菌基因组上的nshA基因失活。采用摇瓶进行发酵,采用HPLC的方法检测发酵液中诺西肽的含量。结果重组菌株的那西肽发酵产量较对照菌株有明显提高。结论 nshA基因对那西肽的生物合成有负调节作用,该基因的失活,有利于那西肽生物合成酶结构基因的表达,使诺西肽的产量有明显提高。     

透明颤菌血红蛋白基因在龟裂链霉菌中的表达及其对土霉素合成的影响

目的 考察透明颤菌血红蛋白基因(vgb)在大肠埃希菌(E. coli)和龟裂链霉菌(S. rimosus)中的表达，研究在不同溶氧条件下表达的透明颤菌血红蛋白(VHb)对龟裂链霉菌生长和土霉素合成的影响。方法 将vgb插入表达型质粒pET-28a中，导入E. coli BL21(DE3)用以表达VHb并测定其活性。以整合型质粒pSET152为载体，利用ermE*启动子组成型表达vgb基因，将构建的质粒通过接合转移整合到S. rimosus M4018基因组上，利用CO差示光谱法和SDS-PAGE鉴定两个重组菌中的血红蛋白。在5L罐上考察不同溶氧条件下VHb的表达对重组龟裂链霉菌生长和土霉素合成的影响。结果 重组大肠埃希菌和重组龟裂链霉菌都能够表达具有生物活性的VHb，发酵结果表明，在117h时与对照菌相比，重组龟裂链霉菌在高氧和低氧条件下的干重分别提高了6%和32%，同时单位干重土霉素的产量分别提高了41%和93%。结论 VHb在重组龟裂链霉菌中成功表达，改善了菌体的生长和土霉素的合成，为解决工业发酵过程中氧限制问题提供了策略。     

旁路代谢酶抑制剂对林可霉素发酵的影响

目的 研究林可链霉菌的发酵工艺,提高林可霉素的产量.方法 在林可链霉菌发酵产林可霉素的过程中,在一定时间添加一定量的旁路代谢酶抑制剂丙氨酸和三甲胺,用生物效价法测定发酵液中林可霉素的产量.结果 在发酵开始时添加0.01％的丙氨酸,同时在24h时添加0.02％的三甲胺,使林可霉素的产量提高26％.实验发现该种添加方法抑制了糖酵解途径中的丙酮酸激酶和莽草酸途径中的邻氨基苯甲酸合成酶的酶活,使菌体内积累高浓度的林可霉素的前体酪氨酸及L-多巴,进而提高了林可霉素的产量.结论 该种发酵工艺使林可霉素产量得到显著提高.     

四霉素A组分高含量基因工程菌的构建

目的通过阻断不吸水链霉菌S91中的四霉素生物合成途径P450单加氧酶基因ttm D,获得四霉素A组分高含量基因工程菌株。方法构建大肠杆菌-链霉菌穿梭重组质粒p KC-D3,通过接合转移将缺失592 bp的ttm D基因以双交换的方式置换不吸水链霉菌S91染色体的ttm D基因,采用摇瓶发酵,采用HPLC检测发酵液中四霉素的组分含量。结果 ttm D基因阻断菌株不吸水链霉菌S91-D不再产生四霉素B,获得了四霉素A高含量的菌株,四霉素A产量提高了47%。结论将不吸水链霉菌S91中的ttm D基因失活,可以阻断四霉素A生成四霉素B,从而提高四霉素A的含量及产量。     

透明颤菌血红蛋白基因(vgb)在阿维链霉菌的整合表达

pHZ1276是透明颤菌血红蛋白基因(vgb)的诱导型表达载体，携带有硫链丝菌素诱导的强启动子PtipA和ФC31int，attP基因使载体整合在染色体上。本研究利用组成型启动子ermP1P2替代pHZ1276上的诱导型启动子PtipA构建了组成型表达血红蛋白基因的质粒pHZ1291。将vgb基因去掉后构建了组成型链霉菌表达载体pHZ1294。将pHZ1276。pHZ1291导人阿维链霉菌(Streptomyces avermitiHs)NRRL8165，所得重组子经Southern杂交验证后，蛋白粗提物经Western杂交和CO结合实验表明vgb基因在该菌中表达出了有活性的VHb蛋白。     

只产阿维菌素B组分的基因工程菌的构建

目的通过对阿维菌素生物合成基因C5-O-甲基转移酶基因(aveD)内部进行缺失,使aveD基因失活,从而获得只产生阿维菌素B组分的基因工程菌。方法构建大肠杆菌-链霉菌重组质粒pZHJ06,通过接合转移将缺失部分片段的aveD基因以双交换的方式整合到阿维链霉菌的染色体上。采用摇瓶进行发酵,采用高效液相色谱(HPLC)检测发酵液中阿维菌素的组分。结果重组菌株不再产生阿维菌素A组分,只产生阿维菌素B组分,并且B组分的总产量也有所提高。结论将阿维链霉菌的aveD基因失活,并不影响下游酮基还原酶基因(aveF)基因的表达,重组菌株只产生阿维菌素B组分。     

透明颤菌血红蛋白对黄芪甲苷生物合成的调控作用

为了研究透明颤菌血红蛋白(Vitreoscilla hemoglobin,VHb)对黄芪甲苷生物合成的调控作用,本文运用农杆菌介导法,将透明颤菌血红蛋白基因(Vitreoscilla hemoglobin gene,vgb)导入黄芪毛状根中,经PCR特征性引物扩增得到54个转基因株系。Southern blot分析,证明vgb基因已经整合到转基因黄芪毛状根基因组中。RT-PCR分析结果表明,vgb基因在转录水平获得表达。转基因黄芪毛状根培养15天,其生长量和增长倍数皆比非转基因黄芪毛状根高;黄芪甲苷含量测定结果显示,转基因黄芪毛状根黄芪甲苷含量是非转基因黄芪毛状根的5～6倍,是山西产黄芪药材的10～12倍。研究结果表明,vgb基因的表达促进了转基因毛状根的生长,提高了黄芪甲苷含量。     

泰乐菌素基因工程菌的构建

目的构建具有双拷贝tylF基因的泰乐菌素基因工程菌,以解决泰乐菌素基因生物合成的限速环节,提高泰乐菌素的发酵产量。方法通过SOE-PCR获得PermE-tylF基因,构建随机整合型重组质粒pBH05,通过接合转移将PermE-tylF基因及其载体随机整合到弗氏链霉菌的基因组中,并通过抗性筛选获得重组菌株D-120。将重组菌株D-120进行摇瓶发酵,采用生物效价测定的二剂量法测定泰乐菌素的发酵单位。结果在相同的发酵条件下,重组菌株泰乐菌素的发酵单位较出发菌株提高32.7%。结论该基因工程菌的构建改善了泰乐菌素生物合成的限速环节,大幅度提高了泰乐菌素的发酵效价。     

双拷贝aveC基因对阿维菌素产量的影响

目的通过在阿维链霉菌染色体上增加aveC基因的拷贝数,提高阿维菌素"1"组分的产量。方法采用基因工程技术,在阿维链霉菌染色体DNA的bkdAB基因中插入一套aveC基因,通过同源双交换得到重组菌株,采用HPLC考察各组分的含量。结果第二套aveC基因正确地插入到基因组DNA的预定部位。然而,对重组菌株发酵产物的HPLC分析显示,阿维菌素"1"组分比例并没有明显的变化,但B1a效价却有显著提高。结论aveC基因产物的活性可能不是决定阿维菌素"1"组分比例的主要因素,但aveC基因产物的活性可能是阿维菌素生物合成的限制因素。     

双拷贝tylD、tylF和tylJ弗氏链霉菌工程菌株构建及其发酵性能研究

以弗氏链霉菌工业生产菌株基因组DNA为模板，扩增泰乐星生物合成及组分转化关键基因tylD、tylF和tylJ，构建双拷贝tylD、tylF、tylJ弗氏链霉菌工程菌株。通过摇瓶发酵验证了工程菌株泰乐菌素发酵效价，并对筛选的一株工程菌利用荧光定量PCR检测其tylD、tylF和tylJ基因表达情况。研究结果表明，双拷贝tylD、tylF、tylJ弗氏链霉菌工程菌株泰乐菌素摇瓶发酵效价较出发菌株最高提高了28.1%，该菌株tylD、tylF、tylJ表达水平高于出发菌株，并且在进入稳定期后期表达量达到最大值。构建双拷贝tylD、tylF、tylJ弗氏链霉菌工程菌株可解除泰乐菌素合成限速环节，大幅度的提高泰乐菌素产量。     

2-Amino-5-oxo-2-tetrahydrofuran carboxylic acids,novel γ-lactone antibacterial agents

设计并合成了五种２－酰胺基－５－氧－２－四氢呋喃羧酸类新的抗菌剂。它们的化学结构经ＭＳ、ＩＲ、１Ｈ－ＮＭＲ证实。合成的化合物对所试的２０株革兰氏阳性和阴性细菌中的大多数具有抗菌活性，化合物３ｅ对大多数菌的抗菌活性与头孢曲松相当。     

vgb在红色糖多孢菌表达及生物活性的研究

利用基因工程技术对红色糖多孢菌进行改造，提高红霉素产率。用PCR技术克隆vgb，采用电穿孔法与红色糖多孢发酵菌染色体整合，鉴定采用Western blot与Southern blotting分析。VHb活性分析采用一氧化碳（CO）差示光谱法，红霉素效价测定采用管碟法。结果克隆了含vgb的红色糖多孢菌表达质粒（pBlueV），筛选了重组红色糖多孢菌株。与原始菌株比较，重组菌株细胞发酵密度分别为1．37与2．82，红霉素效价分别为3．8与5．1，相当于重组菌株提高红霉素体积产率约29％。重组红色糖多孢发酵菌提高了红霉素产率，对解决抗生素工业和基因工程菌高密度发酵有良好的应用前景。     

林可霉素生物合成基因lmbH的回转化

以ＰＩＪ７０２或ＰＩＪ４８６为载体构建了３个含有ｌｍｂＨ基因的重组质粒ｐＥＳＳ７０１、ｐＥＳＳ７０４和ｐＥＳＳ７０８分子,分别回转化林可霉素产生菌Ｂ４８,并随机挑选了６００个回转化克隆进行摇瓶初筛,以抑菌圈直长作为稀理林可霉素产生量的标准。