晚期糖基化终产物对大鼠血管平滑肌细胞增殖影响的实验研究

目的：研究晚期糖基化终产物（Advanced Glycation end Products,AGEs）对体外培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞（Vascular Smooth Muscle Cells,VSMCs）增殖的影响。方法：组织贴块法培养大鼠VSMCs,给予不同浓度AGE-牛血清白蛋白（AGE-BSA）连续处理VSMCs 168 h（7 d）,每24 h采用噻唑蓝（MTT）法检测细胞增殖,绘制细胞生长曲线,计算细胞增殖促进率。结果：80 mg/L终浓度的AGE-BSA在培养72、961、20 h,10、20、40 mg/L终浓度的AGE-BSA在培养96、120、1441、68 h均可显著促进细胞增殖（P〈0.05） 40 mg/L终浓度的AGE-BSA在培养96 h时细胞增殖促进率最大（72.1%）。结论：AGEs具有促进VSMCs增殖作用,这一作用在一定范围内具有剂量依赖性。     

PPARα对糖基化终产物诱导的大鼠血管平滑肌细胞的作用

目的:观察氯贝特对糖基化终产物(AGEs)刺激下的离体大鼠主动脉血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖的作用以及对过氧化物酶体增生物激活受体α(PPARα)基因及蛋白表达水平的影响,探讨PPARα在AGEs诱导VSMCs增殖中的作用。方法:体外培养大鼠VSMCs,应用不同浓度的AGEs分别刺激VSMCs并设立对照组进行比较,采用MTT法观察不同浓度的AGEs对VSMCs增殖的影响及氯贝特与AGEs共孵育对VSMCs增殖的干预作用,并用流式细胞仪检测细胞周期,RT-PCR检测PPARα的mRNA表达,Western blotting分析PPARα的蛋白表达。结果:AGEs增加DNA的合成促进平滑肌细胞的增殖,氯贝特激活PPARα,使PPARα的表达量增加,抑制AGEs诱导的细胞增殖和DNA合成。结论:AGEs诱导平滑肌细胞增殖与平滑肌细胞PPARα表达相关,PPARα表达下调可能是产生糖尿病动脉粥样硬化的重要原因之一。     

血府逐瘀汤对大鼠血管平滑肌细胞迁移的影响

目的观察血府逐瘀汤含药血清对大鼠主动脉平滑肌细胞(VSMCs)增殖、迁移以及其生成一氧化氮(NO)的影响。方法用MTT法观察VSMCs的增殖,Transwell小室法观察VSMCs的迁移,并检测培养上清液一氧化氮(NO)的含量。结果与空白对照组比较,血府逐瘀汤高剂量组和中剂量组能显著抑制VSMCs的增殖和迁移(P0.05);与空白对照组比较,培养48 h的培养上清液中,血府逐瘀汤3个剂量组的NO水平有显著升高(P0.01)。结论血府逐瘀汤含药血清有抗VSMCs增殖和迁移的作用,其作用与升高NO水平有关。     

腺病毒介导gax基因转染对血管平滑肌细胞迁移的影响

目的以腺病毒介导gax基因转染血管平滑肌细胞(VSMC),探讨gax基因表达增强后VSMC迁移的变化.方法以携带大鼠gax基因表达序列的复制缺陷型5型腺病毒载体(AdCMV-gax)常规转染VSMC后,应用免疫细胞化学染色检测gax基因表达的变化,Boyden's小室观察gax基因表达增强对VSMC迁移的影响.结果①AdCMV-gax转染前,PDGF-BB下调Gax蛋白的表达,接近正常生理浓度的PDGF-BB(2 ng/ml)即可使VSMC的Gax蛋白表达率由36.42%显著降低至22.83%(P＜0.05),随着PDGF-BB浓度的升高,gax基因表达下降程度更加显著;AdCMV-gax转染后,无论有无PDGF-BB刺激,VSMC中gax基因的表达均比转染前显著增高.②AdCMV-gax转染使VSMC表达gax增强后,VSMC迁移数较未转染组显著减少.结论增强gax基因表达,可抑制由有丝分裂原刺激所引起的VSMC迁移.     

糖基化终产物对大鼠血管平滑肌细胞骨保护素mRNA表达的影响

目的:研究糖基化终产物(AGEs)对大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)骨保护素(OPG)mRNA表达的影响。方法:体外培养VSMCs,在含10 mmol.L-1β-甘油磷酸(β-GP)的培养液中加入不同浓度(0、50、100、200、400 mg.L-1)的AGE-牛血清白蛋白(BSA)与VSMCs孵育不同时间(0、12、24、36、48、72 h)。采用RT-PCR检测OPG的mRNA表达水平。结果:AGE-BSA呈时间和剂量依赖性地增加VSMCsOPG mRNA的表达;200 mg.L-1的AGE-BSA与VSMCs孵育24 h,OPG mRNA表达水平达到高峰。结论:AGE-BSA能够促进大鼠VSMCsOPG mRNA的表达。     

晚期糖基化终产物对大鼠血管平滑肌细胞分泌炎症性趋化因子的影响及机制

目的 观察晚期糖基化终产物(AGE)对血管平滑肌细胞(VSMC)分泌单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)和白细胞介素8(IL-8)的影响并初步探讨可能的细胞内信号转导机制.方法 分离、培养原代大鼠VSMC并进行鉴定.采用糖基化血清白蛋白(GSA)模拟AGE,观察不同浓度GSA(10、100和500 μg/ml)对VSMC分泌MCP-1和IL-8的影响和时间曲线;并对其进行细胞增殖率校正以消除VSMC数量增加对测定的影响;p38MAPK抑制剂(SB203580)、ERK1/2抑制剂(PD98059)及NF-κB抑制剂(PDTC)、Proteasome抑制剂(MG132)预处理后观察GSA刺激VSMC分泌MCP-1和IL-8水平的改变.结果 与空白对照组相比,100 μg/ml GSA作用24 h VSMC分泌MCP-1(13.01ng/ml±0.12ng/ml比7.02 ng/ml±0.26 ng/ml,P＜0.05)和IL-8(12.6ng/ml±0.86 ng/ml比3.07 ng/ml±0.35ng/ml,P＜0.05)水平最高.经过细胞增殖校正后,GSA仍然能够促进VSMC表达MCP-1和IL-8.MAPK抑制剂和NF-κB抑制剂预处理后发现PDTC(10 μmol/L)、SB203580(5 μmol/L)以及MG132(10 μmol/L)可以抑制GSA刺激VSMC表达MCP-1和IL-8.结论 GSA可以促进VSMC分泌致炎性趋化因子MCP-1和IL-8,这种作用独立于细胞增殖,可能是通过激活细胞内p38MAPK信号转导通路,促进核因子NF-κB的活化而实现.

Abstract：

Objective To investigate the effects of advanced glycation end products (AGEs) on the secretion of monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) and interleukin-8 (IL-8) in vascular smooth muscle cells (VSMCs) and explore its possible intracellular signaling mechanism. Methods Primary rat VSMCs were isolated and identified. VSMCs were treated with glycation serum albumin (GSA), an important component of AGEs, in series of concentrations and time. The role of MAPK and NF-κB inhibitors was confirmed. The levels of MCP-1 and IL-8 were determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Results VSMCs were treated with GSA at the doses of 10 μg/ml, 100 μg/ml and 500 μg/ml respectively. In comparison with the control group, the levels of MCP-1 ( 13.01 ng/ml ± 0.12 ng/ml vs 7. 02 ng/ml ±0. 26 ng/ml, P＜0.05) and IL-8 (12. 6 ng/ml ±0. 86 ng/ml vs 3. 07 ng/ml ±0.35 ng/ml,P＜0.05) increased in the GSA-treated group, especially at the concentration of 100 μg/ml. After adjustment for cells proliferation, the levels of MCP-1 and IL-8 were still higher in the GSA-treated group.After a pretreatment of PDTC ( 10 μmol/L), SB203580 (5 μmol/L) and MG132 ( 10 μmol/L), the levels of MCP-1 and IL-8 decreased. However, it had no change when pretreated with PD98059 (20 μmol/L).Conclusion GSA promotes the secretion of MCP-1 and IL-8 in VSMCs. Such an effect is not dependent on cellular proliferation. It may be realized through an activation of NF-κB by p38MAPK-sensitive intracellular signaling pathway.     

晚期糖化终产物对离体血管平滑肌细胞的影响

探讨晚期糖化终产物对离体新生牛胸主动脉血管平滑肌细胞的影响及机制。方法：观察ＶＳＭＣ受ＡＧＥｓ刺激后其生长,超微结构和血小板源生长因子－Ａ（ＰＤＧＦ－Ａ）的变化以及维生素Ｅ对上述变化的影响。结果：ＡＧＥｓ促进ＶＳＭＣ生长,细胞内ＡＧＥｓ和ＰＤＧＦ－Ａ的免疫反应呈阳性,线粒体和粗面内质网增多。     

自噬在晚期糖基化产物(AGEs)诱导血管平滑肌细胞增殖与迁移中的作用

目的 研究自噬在晚期糖基化产物(AGEs)诱导的平滑肌细胞增殖和迁移中的具体作用。方法 用AGEs处理血管平滑肌细胞后,Western blot法观察自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和SQSTM1/p62的表达变化;MTT实验检测细胞增殖水平;细胞小室实验测定细胞迁移的能力。结果 AGEs刺激血管平滑肌细胞后,自噬相关蛋白LC3-Ⅱ表达增加,SQSTM1/p62表达减少。与对照组相比,AGEs(100μg/ml)处理组显著增强血管平滑肌细胞的增殖和迁移能力。但是,使用自噬抑制剂3-MA预处理血管平滑肌细胞可减弱这种现象。结论 本研究证实AGEs诱导的自噬可增强AGEs诱导的血管平滑肌细胞的增殖和迁移能力。     

舒脉胶囊对血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞迁移的影响

目的 观察舒脉胶囊及其拆方药物血清对血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,AngⅡ)诱导的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)迁移的影响.方法 采用组织贴块法进行VSMC培养,AngⅡ 10-7 mol/L作为刺激因子,将药物血清分为舒脉胶囊全方组、活血化瘀拆方组和补脾益肾拆方组,测微尺测量细胞迁移的距离,免疫组织化学法测量基质金属蛋白酶-2(metalloproteinase-2,MMP-2)的表达情况.结果 与AngⅡ组比较,舒脉胶囊全方组、活血化瘀拆方组细胞迁移距离显著减小(P<0.01),MMP-2表达减少(P<0.01),其中舒脉胶囊全方组细胞迁移距离显著小于活血化瘀拆方组(P<0.01).结论 舒脉胶囊通过抑制MMP-2的表达而抑制VSMC迁移,全方作用优于拆方.     

舒脉胶囊对血管紧张素Ⅱ诱导的血管平滑肌细胞迁移的影响

目的观察舒脉胶囊及其拆方药物血清对血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)诱导的血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cells,VSMC)迁移的影响。方法采用组织贴块法进行VSMC培养,AngⅡ10-7 mol/L作为刺激因子,将药物血清分为舒脉胶囊全方组、活血化瘀拆方组和补脾益肾拆方组,测微尺测量细胞迁移的距离,免疫组织化学法测量基质金属蛋白酶-2(metalloproteinase-2,MMP-2)的表达情况。结果与AngⅡ组比较,舒脉胶囊全方组、活血化瘀拆方组细胞迁移距离显著减小(P<0.01),MMP-2表达减少(P<0.01),其中舒脉胶囊全方组细胞迁移距离显著小于活血化瘀拆方组(P<0.01)。结论舒脉胶囊通过抑制MMP-2的表达而抑制VSMC迁移,全方作用优于拆方。     

苯那普利对糖尿病大鼠肾组织RAGE表达的影响

目的通过研究苯那普利对糖尿病大鼠肾脏组织糖化终末产物受体(RAGE)表达的影响,探讨其肾保护机制。方法30只SD大鼠随机分为正常对照组(n=10)、糖尿病对照组(n=10)和糖尿病苯那普利处理组(n=10)。实验第12周末,分别计算各组大鼠肾质量/体质量比值;检测血糖、糖化血红蛋白(HbA1c)和血脂水平,并行24 h尿蛋白定量;运用RT-PCR法测定大鼠肾组织RAGE mRNA表达。结果与正常对照组比较,糖尿病对照组和糖尿病苯那普利处理组大鼠的血糖、HbA1c、甘油三酯、总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇均明显升高(P<0.05),高密度脂蛋白胆固醇明显降低(P<0.05),而糖尿病对照组与糖尿病苯那普利处理组之间上述指标比较无显著差异(P>0.05)。糖尿病苯那普利处理组大鼠的肾质量/体质量比值、24 h尿蛋白定量和肾组织RAGE mRNA表达明显高于正常对照组大鼠(P<0.05),但显著低于糖尿病对照组大鼠(P<0.05)。结论苯那普利可抑制糖尿病大鼠肾脏肥大并降低尿蛋白排泄率,其作用机制可能与抑制RAGE表达有关。     

AGEs-RAGE相互作用促进巨噬细胞摄取胆固醇的研究

目的观察糖基化终末产物(advanced glycation end products, AGEs) 及其受体(receptor of advanced glycation end products, RAGE)对巨噬细胞胆固醇摄取功能的影响。方法 培养THP-1细胞株,用PMA诱导分化使其成为巨噬细胞,以100μg/ml的氧化LDL(oxidized LDL, oxLDL)孵育细胞使其转化为泡沫细胞。分别以浓度为300、600μg/ml的AGEs对细胞进行刺激,应用用浓度为10μg/ml的抗RAGE抗体对细胞进行预处理,采用油红O染色测定细胞内脂质含量,通过RT-PCR及Western印迹法来检测各组巨噬细胞RAGE表达以及与胆固醇摄取相关因子SRA2、CD36表达变化,将干预后的巨噬细胞与荧光标记的oxLDL共同孵育,动态观察巨噬细胞在不同干预条件下胆固醇摄取功能的变化。结果 高浓度AGEs诱导后,巨噬细胞内脂质含量增加,RAGE表达增加,SRA2、CD36表达增加,巨噬细胞胆固醇摄取能力增加。应用抗体阻断RAGE轴后,AGEs引起的改变均有明显恢复。结论 AGEs-RAGE相互作用可以促进巨噬细胞摄取胆固醇,增加细胞内脂质累积,从而易于形成泡沫细胞。     

内源性可溶性糖化终末产物受体和内源性分泌型糖化终末产物受体水平对糖尿病性骨质疏松症的诊断价值

目的探讨内源性可溶性糖化终末产物受体(sRAGE)和内源性分泌型糖化终末产物受体(esRAGE)对糖尿病性骨质疏松症的诊断价值。方法 59例≥50岁髋部骨折住院患者分为非糖尿病组(Ⅰ组,20例)、糖尿病非骨质疏松症组(Ⅱ组,21例)及糖尿病合并骨质疏松症组(Ⅲ组,18例),用双能X线骨密度仪检测骨密度(BMD),酶联免疫吸附测定法检测血浆sRAGE、esRAGE水平,并检测空腹血糖(FBG)、糖化血红蛋白(HbA1c)、三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、肌酐(Cr)、碱性磷酸酶(AKP)、钙(Ca)等生物化学指标及体质量指数(BMI)。结果 3组患者的BMI、Cr、TG、TC、AKP水平差异均无统计学意义(P>0.05),Ⅰ组和Ⅱ组患者血浆Ca水平比较差异无统计学意义(P>0.05),但与Ⅲ组Ca水平比较差异均有统计学意义(P<0.01);3组间血浆FBG、HbA1c、BMD、sRAGE、esRAGE水平比较差异均有统计学意义(P<0.01);sRAGE、esRAGE水平与FBG、HbA1c呈负相关(P<0.01),与BMD呈正相关(P<0.01)。结论血浆sRAGE、esRAGE可能成为糖尿病性骨质疏松症的诊断指标。     

心力衰竭患者血浆可溶性晚期糖基化终末产物受体（sRAGE）变化与心功能的关系

目的：探讨心力衰竭患者血浆可溶性晚期糖基化终末产物受体（soluble receptor for advanced glycation endproducts, RAGE）浓度变化,分析 sRAGE 与心功能的关系。方法选择首都医科大学附属北京同仁医院就诊的心力衰竭患者,纽约心脏学会（New York Heart Association,NYHA）心功能分级为Ⅱ~Ⅳ级,同期住院非心力衰竭患者为对照组,用酶联免疫吸附测定法方法定量检测血浆 sRAGE 浓度,对比分析各组间血浆 sRAGE 浓度的差异。结果血浆 sRAGE 浓度在对照组为（0.562±0.473）ng/mL,心力衰竭组为（0.844±0.705）ng/ mL,2组间比较差异有统计学意义（P〈0.01）。血浆 sRAGE 浓度在 NYHAⅡ级组为（0.680±0.506）ng/ mL、NYHAⅢ级组（0.844±0.646）ng/ mL、NYHAⅣ级组（91.077±0.910）ng/ mL。各组间比较差异有统计学意义（P〈0.05）。结论心力衰竭患者血浆 sRAGE 水平升高,且与心力衰竭的严重程度相关。     

吡格列酮对血管内皮细胞及JNK信号通路的影响

目的 探讨吡格列酮(PIO)对血管内皮细胞的保护作用及其可能机制.方法 用四唑盐比色法(MTT法)检测PIO对高糖损伤血管内皮细胞的最佳保护浓度;按不同干预条件,将血管内皮细胞分为7组:正常培养组[A组,葡萄糖(Glu) 5.5 mmol/L],高糖培养组(B组,Glu 37.5 mmol/L),C、D、E组分别为不同...     

2型糖尿病合并慢性肾脏病的临床病理特点及其损伤机制

目的探究2型糖尿病合并慢性肾病(DCKD)的临床病理特点及其内在的损伤机制。方法回顾分析2型糖尿病合并慢性肾病的临床病理特点,用免疫组化及蛋白免疫印记检测其肾脏组织糖基化终末产物受体(RAGE)的表达量,并与其临床特征作相关性分析。结果 DCKD组病理分型多样,以IgA肾病最多;而单纯糖尿病肾病(DN)组则相对单一。DCKD组病例的发病年龄(46±5)岁、糖尿病病程(39±6)月均低于DN组,两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。但DCKD组发生血尿(62.8%)、蛋白尿(51.4%)的比例高,且大多数缺乏典型的糖尿病视网膜病变;其RAGE表达富集上调。结论 2型糖尿病合并慢性肾脏病的临床特征与病程不符,病理分型多样,诊断仍需依靠肾活检;其肾损害与AGEs-RAGE轴密切相关,可为临床治疗提供有用的信息。     

可溶性晚期糖基化终末产物受体及其基因多态性与2型糖尿病的易感性分析

目的 探讨可溶性晚期糖基化终末产物受体(sRAGE)水平及晚期糖基化终末产物受体(RAGE)基因单核苷酸位点多态性与2型糖尿病的关联。方法 选择184例2型糖尿病患者作为糖尿病组,190例健康体检者作为正常对照组。ELISA方法检测sRAGE水平,PCR-TaqMan-MGB探针检测rs2070600、rs1800624、rs1800625及rs184003基因分型。结果 糖尿病组sRAGE水平[M(P₂₅,P₇₅)]为1087.4(713.5,1213.4)pg/mL,正常对照组sRAGE为908.2(674.6,1107.1)pg/mL,两组差异有统计学意义(P<0.001)。糖尿病组与正常对照组间4个位点的最小等位基因频率分布均无统计学差异,且在基因型分析中也无阳性发现。线性相关分析表明,4个位点与sRAGE水平均无明显关联性。结论 sRAGE水平与2型糖尿病的发病相关,但RAGE位点多态性与糖尿病无明显关联。RAGE位点多态性与sRAGE水平无关联。     

RAGE基因型在2型糖尿病伴慢性牙周炎患者颊黏膜中的检测

目的 对2型糖尿病伴慢性牙周炎患者颊黏膜中糖基化终产物受体(RAGE)进行检测,探讨其可能致病位点基因型.方法 分别选取2型糖尿病伴慢性牙周炎患者(DMCP组)、单纯慢性牙周炎患者(CP组)和健康对照组(H组)各50例.采集颊拭子,进行牙周检查,对比牙周状况.从样本中提取DNA,RAGE PCR产物检测,PCR质量控制,限制性内切酶酶切产物,确定可能的基因型.结果 RAGE基因中-429T/C位点和2184A/G位点在DMCP组、CP组和H组中无统计学差异(P＞0.05),而1704G/T位点GG基因型在DMCP组和CP组的表达要高于H组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 RAGE基因中内含子区域1704G/T位点GG基因型在DMCP组和CP组中出现频率高.2型糖尿病伴慢性牙周炎和单纯慢性牙周炎可能与1704G/T位点GG基因型表达有关.     

分泌型晚期糖基化终产物受体对妊娠糖尿病胚胎保护的实验研究

【摘要】目的 研究分泌型晚期糖基化终产物受体（sRAGE）在实验动物罹患妊娠糖尿病（GDM）时的表达差异及对子鼠发育的影响。方法 采用给SD孕鼠空腹一次性腹腔注射链脲佐菌素（STZ）25mg/kg的方法建立宫内高血糖孕鼠模型。STZ注射后对小鼠随机分为实验组和对照组,每间隔24小时,实验组孕鼠行尾静脉注射重组sRAGE蛋白（5 mg/kg, 0.2 ml PBS）即为sRAGE组,对照组注射相同剂量的白蛋白溶液。分别于第3、13、19天检测孕鼠血糖、血清AGEs及脑、心脏组织中的RAGE蛋白水平。最后一日剖宫取胎,剥离胎盘,检测胎盘RAGE、NOX2、MCP-1、VCAM-1的mRNA表达水平,探讨血清中AGEs、RAGE表达水平与胚胎发育的关系。结果 实验组孕鼠血清中血糖和AGEs的浓度显著高于对照组(P＜0.05),相关性分析显示血糖与血清中AGEs水平呈显著正相关(r=0.693,P＜0.05);与正常对照组相比,实验组孕鼠的胎盘、脑及心脏组织中活性氧产生,炎症相关基因的mRNA和RAGE蛋白水平显著升高,而sRAGE处理可以部分降低这些活性氧产生、炎症相关基因的表达和RAGE的表达。对照组孕鼠胎盘、脑以及心脏组织中的RAGE蛋白表达极弱,实验组在3种组织中的RAGE表达则明显增强。在sRAGE注射干预后,RAGE蛋白表达与实验组相比显著降低,仍高于对照组。结论sRAGE静脉注射可显著降低孕鼠子代组织中NF-κB的活性,通过调控相关细胞因子发挥对胚胎的保护作用。     

晚期糖化终末产物对大鼠海马神经元的损伤作用与机制

目的研究晚期糖化终末产物(AGEs)对海马神经元存活、生长的影响和机制,以探讨AGEs在阿尔茨海默病发生中的作用。方法取培养1 d的新生大鼠海马神经元,分为对照组和AGEs-BSA组。在含终浓度为100 mg.L-1、500 mg.L-1、2000 mg.L-1的牛血清白蛋白(BSA)或AGEs-BSA的培养液中培养24 h,显微镜下观察神经元形态变化,噻唑蓝(MTT)法测定神经元存活率,硫代巴比妥法测定神经元脂质过氧化物(LPO)含量。结果100 mg.L-1BSA或AGEs-BSA条件下,2组海马神经元的形态、存活率及LPO含量均无明显差异(P>0.05)。500 mg.L-1和2 000 mg.L-1条件下,AGEs-BSA组的海马神经元生长状况均较差,细胞存活率均降低(P<0.05,P<0.01),LPO含量均升高(P<0.05,P<0.01),且2 000 mg.L-1组上述变化更显著(P<0.01)。结论AGEs对体外培养的海马神经元有剂量依赖性损伤作用。过氧化应激是AGEs损伤海马神经元的途径之一。