NPM1 A型突变体对TGF-β1诱导K562细胞增殖及AKT磷酸化的影响

  目的  观察核仁磷酸蛋白（nucleophosmin 1,NPM1）A型突变体过表达对TGF-β1诱导的K562细胞增殖及AKT磷酸化的影响。  方法  腺病毒载体（Ad5－NPM1）转染髓系白血病K562细胞建立过表达NPM1蛋白细胞株;应用Western blot法及ELISA法分别检测细胞NPM1蛋白表达及上清液含量,Western blot法检测K562细胞NPM1、AKT和P-AKT蛋白表达,MTT法检测细胞增殖。  结果  K562细胞NPM1蛋白表达水平呈Ad5-NPM1转染复数[（multiplicity of infection,MOI）:30-200]依赖性增加,与空载组（Ad5-vector-100）相比,Ad5-NPM1-30、Ad5-NPM1-100组K562细胞及细胞上清液NPM1蛋白水平均显著增高（P < 0.01）。TGF-β1（10 ng/mL）能够诱导K562细胞AKT蛋白磷酸化,但对总AKT水平无明显影响。TGF-β1（10 ng/mL）+Ad5-NPM1-100组K562细胞P-AKT水平显著高于TGF-β1处理组（P < 0.05）,各组总AKT水平无显著差别（P>0.05）。与空白对照组（CT）相比,TGF-β1（10 ng/mL）处理可促进K562细胞增殖;但TGF-β1（10 ng/mL）+Ad5-NPM1-100组细胞的增殖水平明显高于TGF-β1处理组（P < 0.01）。  结论  NPM1可促进TGF-β1诱导的K562细胞增殖。NPM1促进TGF-β1诱导的K562细胞可能与AKT磷酸化有关。      

过表达SHP-1对人慢性髓系白血病急变细胞系K562生物学特征的影响

目的 探讨SHP-1基因对K562细胞系增殖、凋亡、细胞周期分布和集落形成的影响。方法 将携带SHP-1基因和绿色荧光蛋白（EGFP）基因的慢病毒表达载体转染K562细胞,SYBR Green荧光定量PCR和Western blot法检测转染细胞SHP-1 mRNA和蛋白的表达情况;CCK-8法检测细胞增殖;流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞周期分布;光学显微镜和电子显微镜下观察细胞形态;TUNEL法检测细胞凋亡;培养细胞集落并比较不同组间集落形成的数量和大小。结果 培养第3天,K562SHP-1细胞的OD值为（0.35±0.02）,K562EGFP细胞的OD值为（0.47±0.05）,两者差异有统计学意义（P=0.011）。随着培养天数的延长,与K562EGFP细胞相比K562SHP-1细胞出现G0/G1期细胞比例增加和G2/M+S期细胞比例降低及凋亡增加,培养第5天K562SHP-1细胞G0/G1期比例为（56.37±2.27）、凋亡率为（26.13±1.16）,K562EGFP细胞G0/G1期比例为（31.67±3.21）,凋亡率为（9.00±1.22）,两者比较差有统计学意义（P=0.000）。K562SHP-1细胞集落形成能力（26.3±5.2）较K562EGFP细胞（54.7±8.6）有所降低（P=0.000）;K562SHP-1细胞BCR-ABL1蛋白的表达水平（0.78±0.15）低于K562EGFP细胞（1.27± 0.24）（P=0.040）。结论 过表达SHP-1基因抑制K562细胞增殖和集落形成,促进细胞凋亡,导致细胞周期阻滞在G₀/G₁期,并降低K562细胞中BCR-ABL1蛋白水平。     

重组反义c-myc腺病毒抑制K562细胞生长、诱导凋亡的作用

目的：研究重组反义cmyc腺病毒（Ad—AS-c-myc）对人慢性粒细胞K562细胞系抑制生长，诱导凋亡作用及分子机制，探讨Ad-As-c—myc用于慢性粒细胞白血病基因治疗的可能性。方法：采用重组腺病毒Lac—Z（Ad—LacZ）及Ad—AS-c—myc联合多聚季胺转染K562细胞，Xgal染色判断转染效率。采用形态学、MTT试验、RT—PCR、DNA凝胶电泳、流式细胞仪及免疫细胞化学等方法进行研究。结果：多聚阳离子可提高腺病毒载体对K562细胞的转染，Ad—LacZ＋多聚季胺转染率达86％。AdAS—c—myc能抑制K562细胞c—myc基因在转录水平的表达，K562细胞生长受抑（抑制率38％）；Ad—AS-c—myc可使K562细胞G2、G2期阻滞，增殖相关基因PCNA表达降低，Apo2．7蛋白阳性细胞率增高，DNA电泳出现DNA梯形条带。结论：Ad—AS-c-myc对K562细胞具有抑制生长及诱导凋亡作用，其生物学作用与K562细胞c-myc及PCNA的表达降低有关。Ad-AS-c-myc在慢性粒细胞白血病基因治疗中具有潜在的临床价值。     

重组腺病毒Ad5F35-SH2-DED对K562细胞裸鼠致瘤能力的影响

目的:研究融合蛋白SH2-DED(SD)对白血病K562细胞裸鼠皮下移植瘤的影响.方法:建立K562细胞裸鼠皮下移植瘤的重组腺病毒预防和治疗模型.预防模型采用皮下注射经重组腺病毒Ad5F35-SD或Ad5F35-SmD预处理的K562细胞;治疗模型采用皮下注射K562细胞建立皮下移植瘤后,进行Ad5F35-SD或Ad5F35-SmD的瘤体内多点注射.观察裸鼠移植瘤的生长情况以及移植瘤肿瘤细胞的形态学变化.应用TUNEL法和电子显微镜观察移植瘤肿瘤细胞的凋亡情况.结果:治疗模型组中,Ad5F35-SD处理组移植瘤体积明显缩小,肿瘤细胞核浓缩,细胞质染色加深.TUNEL法和电子显微镜检测结果提示,肿瘤细胞发生凋亡,且凋亡相关蛋白caspase-3和caspase-8表达上调.Ad5F35-SD在预防模型组中同样具有抑制移植瘤生长的作用.结论:重组腺病毒Ad5F35-SD能够抑制K562细胞在裸鼠体内的致瘤能力以及裸鼠皮下移植瘤的生长,并促进肿瘤细胞凋亡.     

腺病毒载体介导的发夹状RNA抑制三氧化二砷耐药的K562/AS2细胞MRP1基因表达的实验研究

 目的　构建MRP1特异性发夹状RNA（shRNA）重组腺病毒载体,并研究其对耐三氧化二砷（ATO）的白血病K562／AS2细胞MRP1基因表达的抑制作用。方法　构建MRP1特异性shRNA重组腺病毒,并感染K562／AS2细胞;用荧光实时定量PCR法分析MRP1 mRNA的表达水平;流式细胞术检测MRP1蛋白表达;MTT法检测该细胞对ATO及依托泊苷（VP16）的细胞毒作用。结果　pAd-EGFP-U6-MRP1-shRNA重组腺病毒感染前后,K562／AS2细胞中MRP1 mRNA和蛋白表达水平分别为（34.70±0.28）、（4.19±0.03）（P＜0.05） 和 （26.40±0.16）、（10.85±0.37）（P＜0.05）;感染前后K562／AS2细胞对ATO及VP16耐药倍数分别为（11.4078±0.3183）、（1.6126±0.3015）和（5.9141±0.0149）、（1.7664±0.1038）,逆转倍数分别为（7.2409±1.3668）和（3.3555±0.1886）（P＜0.05）。结论　成功构建了pAd-EGFP-U6-MRP1-shRNA重组腺病毒载体,该载体感染K562／AS2细胞后可抑制细胞MRP1基因表达以及逆转该细胞对ATO和VP16的耐药。     

RGD修饰的腺病毒介导LIF和IL-24双基因共表达对MEG01白血病细胞的抑制作用

目的 利用RGD修饰改造白血病抑制因子（LIF）和白细胞介素 24（IL-24）双基因共表达腺病毒载体,以提高感染效率,探讨其对人白血病MEG01细胞的抑制作用。方法 同源重组法构建RGD修饰的表达LIF、IL 24的腺病毒载体Ad.RGD-LIF、Ad.RGD -IL24和Ad.RGD-LIF-IL24。在QBI-293A细胞中扩增腺病毒,检测病毒滴度。流式细胞仪检测各组腺病毒载体对MEG01细胞的感染效率。应用Western blotting检测目的基因LIF、IL-24在MEG01细胞中的表达。CCK-8法检测各组腺病毒载体Ad.RGD-LIF、Ad.RGD-IL24、Ad.RGD-LIF-IL24感染MEG01细胞后对细胞增殖的影响。PE-AnexinV／7-AAD双染后,经流式细胞仪检测细胞凋亡的变化。Western blotting检测凋亡相关蛋白的表达。PI染色后,流式细胞仪检测目的基因表达对MEG01细胞周期的影响。实时定量PCR检测细胞周期调控基因p21和E2F1的表达。结果 成功构建了RGD修饰的腺病毒载体Ad.RGD-LIF、Ad.RGD-IL24和Ad.RGD-LIF-IL24。RGD修饰后的腺病毒能够显著增强对MEG01细胞的感染效率。CCK-8检测显示,与PBS组比较,携带单个目的基因的腺病毒载体Ad.RGD-LIF和Ad.RGD-IL24在第5 d对细胞生长的抑制率分别为29.2％和31.5％,均能够显著抑制MEG01细胞的生长;携带Ad.RGD-LIF-IL24双基因组的抑制率达42.5％,优于单基因组,差异均有统计学意义（P＜0.05）。凋亡检测显示,与PBS组（4.5％）和空病毒组Ad.RGD（7.4％）比较,Ad.RGD-IL24（20.9％）、Ad.RGD LIF（17.8％）均能够显著促进细胞凋亡,且Ad.RGD-LIF-IL24双基因组（29.7％）的促凋亡作用更强。Western blotting显示,LIF和IL-24能够提高促凋亡蛋白p53、Bax的表达,同时抑制抗凋亡蛋白Bcl-xl的表达。目的基因LIF、IL-24过表达会影响MEG01细胞周期的进程,使细胞阻滞在G2期。实时定量PCR显示,LIF和IL-24能够上调细胞周期调控基因p21的转录,抑制E2F1的表达。结论LIF和IL-24过表达的腺病毒载体在体外通过调节p53、Bax、Bcl-xl的表达,影响白血病细胞MEG01的生长,诱导其凋亡,并通过调控p21、E2F1的水平影响细胞周期的进程。     

重组人血管内皮生长因子165对K562白血病细胞生物学活性的影响

目的：探讨人重组血管内皮生长的因子165对人K562白血病细胞生物学活性的影响。方法：利用pcDNA3.1（＋）质粒构建人重组含VEGF165的真核表达载体,脂质体转染至K562白血病细胞,并用G418筛选阳性克隆;以RT-PCR测定重组质粒载体VEGF165基因的表达;MTT法测定K562白血病细胞的生长;建立裸鼠皮下移植人K562肿瘤模型,测定肿瘤体积的大小;免疫组化检测肿瘤的微血管密度（MVD）。结果：成功构建pcDNA3.1（＋）-VEGF165表达质粒。K562白血病细胞转染重组质粒后,明显增加K562细胞中VEGF165 mRNA的表达,转染重组质粒的K562细胞增殖明显快于对照组;移植重组pcDNA3.1（＋）-VEGF165质粒转染的K562细胞之后,荷瘤鼠移植瘤生长明显快于对照组;并且移植瘤组织微血管密度明显高于对照组（P〈0.05）。结论：利用pc DNA3.1（＋）真核表达质粒可成功构建含人VEGF165的重组质粒,重组质粒转染K562细胞后,体内外均明显促进K562细胞增殖。     

白细胞介素-24 delE5对人类白血病细胞系K562的抑制作用

 目的　探索白细胞介素（IL）-24 delE5对人类白血病细胞系K562的抑制作用。方法　用TPA诱导白血病细胞系U937和HL-60向单核-巨噬细胞分化后,检测mda-7／IL-24及其选择性剪接体IL-24 delE5的表达。构建IL-24 delE5真核表达载体,稳定转染K562细胞。通过MTT法、集落形成实验、流式细胞术、Annexin-Ⅴ／PI检测及动物实验,观察IL-24 delE5对K562细胞增殖、集落形成、细胞周期、凋亡及体内致瘤性的影响;同时与mda-7／IL-24进行比较。结果　在TPA诱导分化的U937和HL-60细胞中发现IL-24 delE5的表达。稳定转染IL-24 delE5的K562增殖及集落形成明显下降,与空载体相比,G0／G1期细胞比例由（24.46±3.99）%增至（42.69±3.04）%,细胞周期阻滞于G0／G1期,体内实验证实K562细胞移植瘤生长明显被抑制。与mda-7／IL-24相比,上述各实验结果差异均无统计学意义。结论　IL-24 delE5与mda-7／IL-24一样对人类白血病细胞系K562具有明显的体内外抑制作用,该作用可能与IL-24 delE5所引起细胞周期G0／G1期阻滞有关。     

Cyclin D1基因沉默对K562细胞增殖及凋亡的影响

[目的]利用RNA干扰（RNAi）技术观测其对白血病K562细胞cyelin D1基因的沉默效应及对细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响。[方法]体外构建靶向cyclin D1基因的小发夹RNA（shRNA）表达质粒．通过壳聚糖介导转染K562细胞，Western blot分析检测转染前后cyclin D1蛋白表达变化；集落形成实验检测细胞增殖能力；流式细胞仪检测细胞周期分布及凋亡情况。[结果]构建靶向cyclinD1基因的shRNA表达质粒（pshRNA-419和pshRNA-575）经壳聚糖转染后，能显著抑制cyelin D1基因表达；抑制K562细胞增殖，影响其集落形成能力；细胞阻滞于G0／G1期，细胞凋亡明显。而m—pshRNA-790质粒并无上述生物学效应：[结论]cyclinD1基因表达下调可抑制K562细胞生长影响细胞周期分布并诱导细胞凋亡提示，因可能是白血病治疗的一个有效靶点。     

腺病毒介导p16基因的表达及其对肺癌细胞的周期阻滞作用

目的:以增殖缺陷型腺病毒载体介导p16基因感染人肺腺癌细胞系,观察并鉴定该基因在细胞中的表达及其对细胞周期和细胞凋亡的影响.方法:采用293细胞内同源重组的方法,制备重组腺病毒Ad5-p16,感染肺腺癌细胞SPC-A1;免疫组化方法鉴定P16蛋白的表达;台盼蓝染色计数活细胞数,绘制细胞生长曲线;流式细胞术(FCM)分析细胞周期及细胞凋亡的变化.结果:以M0I=10的重组增殖缺陷型腺病毒Ad5-p16感染SPC-A1细胞48 h后,P16蛋白表达的阳性细胞比率为71%;以MOI=100感染SPC-A1细胞后第2天,细胞开始出现生长抑制及细胞病变;FCM分析发现细胞在感染腺病毒后出现细胞周期阻滞和细胞凋亡.结论:以腺病毒为载体介导p16基因在SPC-A1细胞内表达,可发挥抑制细胞生长、诱发细胞凋亡的作用.本项基因治疗策略以直接调控细胞周期的抑癌基因为靶向治疗基因,为肺癌基因治疗提供了可靠的理论依据.     

辛伐他汀引起的Ras-ERK途径改变对K562细胞增殖和凋亡的调节

目的 探讨辛伐他汀作用K562细胞后的Ras-细胞外信号调节激酶(ERK)信号转导通路分子水平的变化,以说明辛伐他汀通过引起Ras-ERK信号通路分子水平的变化参与K562细胞细胞增殖和细胞凋亡的调节.方法 体外用辛伐他汀处理慢性粒细胞白血病细胞株K562细胞,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞增殖抑制率,用流式细胞术检测辛伐他汀作用后的细胞周期和凋亡率的变化,用逆转录聚合酶链反应检测Ras-ERK信号通路分子在转录水平的变化.结果 辛伐他汀能抑制K562细胞的增殖,使K562细胞停滞在G_0-G_1期,明显诱导K562细胞凋亡,Ras-ERK信号通路的大多数分子在转录水平出现差异表达.结论 辛伐他汀可能通过作用于参与细胞增殖和凋亡的Ras-ERK信号通路抑制K562细胞增殖并诱导细胞凋亡.     

In vitro effect of adenovirus-mediated human Gamma Interferon gene transfer into human mesenchymal stem cells for chronic myelogenous leukemia

For developing gene therapy for chronic myelogenous leukemia (CML), we evaluated the feasibility of using autologous bone marrow stromal cells (BMSCs) of one CML patient as a target cell population and studied the efficiency of recombinant adenovirus-mediated human Gamma Interferon (hIFN-gamma) gene transfer into BMSCs. BMSCs can be readily obtained, expanded, and successfully transduced with adenoviral vectors in vitro. We studied the in vitro expression of hIFN-gamma in human BMSCs following transduction with Ad/hIFN-gamma. On transduction of BMSCs at a MOI of 50, the expression and secretion of hIFN-gamma were achieved as high as 5492 +/- 660 approximately 50647 +/- 4049 ng/10(6) cells per 24 h over the course of 3 weeks. We further studied the effects of hIFN-gamma produced by transduced BMSCs on the proliferation of the human leukemia cell line K562 cells in vitro, proliferation of K562 cells was markedly inhibited in the experimental groups as compared with the other two control groups after 5 days of coculture. We also found that the percentage of K562 cells in the G(1) phase of cell cycle can be increased by treatment of hIFN-gamma produced by Ad/hIFN-gamma transduced BMSCs, but the percentage of K562 cells in the S phase of cell cycle can be decreased in the same time. Apoptosis rate of K562 cells in the experimental groups was 30.8 +/- 8.5%, as compared with the other two control groups (5.6 +/- 1.3% and 5.5 +/- 0.8%, respectively) (p < 0.01). Our results indicate that hIFN-gamma gene engineered BMSCs of CML donors could be successfully established and that local production of hIFN-gamma is sufficiently to inhibit the proliferation of K562 cells and induce apoptosis of K562 cells in vitro, suggesting an important potential use in the clinical gene therapy of CML.     

未知基因KH的真核表达载体构建及其对细胞增殖的影响

目的 构建未知基因KH的开放阅读框架(KH-ORF)的真核表达体系,初步探讨未知基因KH对细胞增殖的影响。方法 采用DNA重组技术构建KH-ORF的表达载体pCI-neo-KH-ORF,通过脂质体法转染COS-7细胞和K562细胞,RT-PCR检测目的基因的表达。采用流式细胞术检测：KH-ORF对COS-7细胞和K562细胞周期的影响,四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测KH-ORF对COS-7细胞增殖速度的影响,生长曲线与乳酸脱氢酶(LDH)活性测定检测KH-ORF对K562细胞增殖速度的影响。结果 (1)KH-ORF在COS-7细胞与K562细胞中获得表达。(2)KH-ORF对COS-7细胞的细胞周期与增殖速度无明显影响。(3)流式细胞术检测显示,KH-ORF使K562／pCi-KH-ORF细胞周期中S期细胞增多;生长曲线显示,KH-ORF促进K562／pCI-KH-ORF细胞增殖;LDH活性测定结果表明,K562／pCI-KH-ORF细胞LDH比活性上升,高于对照组细胞。结论 KH基因可能是一个与K562细胞增殖有关的白血病未知基因。     

靶向激活蛋白激酶PKR对白血病K562细胞增殖的影响及机制

背景与目的:由t(9;22)(q34;q11)导致的bcr-abl融合基因在慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)发病中起着重要的作用.本研究运用CML特异的bcr/abl融合基因的mRNA与外源重组反义RNA形成双链RNA (double strand RNA,dsRNA)能激活双链RNA依赖性蛋白激酶(double-stranded RNA-dependent protein kinase,PKR)的策略,研究其对白血病K562细胞增殖的影响及可能的机制.方法:将dsRNA类似物聚肌苷酸-聚胞啶酸(Polyriboinosinic Polyribocytidylic Acid,polyIC)、含ber/abl融合基因序列40bp的逆转录病毒载体RV-40AS、RV-40AS 2-氨基嘌呤(2-aminopurine,2AP)和含绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的逆转录病毒载体RV-GFP作用于K562细胞,并以ECV304细胞作对照细胞株.通过细胞计数、MTT法和半固体集落形成实验检测其对细胞生长增殖的影响,用流式细胞仪检测处理前后细胞周期的变化,用Western blot法检测细胞内PKR、磷酸化PKR(phosphated PKR,p-PKR)、真核翻译启始因子2α(eukaryotic initiation factor-2α,eIF2α)、磷酸化eIF2α(phosphated eIF2α,p-eIF2α)蛋白表达的变化,用3H-亮氨酸掺入实验检测细胞总蛋白合成水平的变化.结果:polyIC对K562细胞和ECV304细胞生长和增殖均具有非特异性抑制作用.而RV-40AS仅对K562细胞具有特异性的抑制效应.PKR抑制剂能阻断RV-40AS对K562 细胞的抑制效应.polyIC和RV-40AS作用K562细胞24 h 后,S期细胞减少[polyIC组(37.26±2.35)%,未处理组(58.53±5.42)%,P＜0.05;RV-40AS组(31.48±3.65)%,未处理组(58.53±5.42)%,P＜0.05],G0/G1期细胞增多[pdylC组(50.97±2.18)%,未处理组(36.44±4.20)%,P＜0.05;RV-40AS组(57.47±3.61)%, 未处理组(36.44±4.20)%,P＜0.05].polyIC处理K562细胞组、ECV304细胞组以及RV-40AS处理K562细胞组的p-PKR和p-eIF2α蛋白表达显著上调,且总蛋白合成水平下降[RV-40AS处理的K562细胞组(3.5±1.9)cpm/ng,未处理组(26.8±2.6)cpm/ng,P＜0.05].结论:外源重组反义RNA与bcr/abl融合基因的mRNA形成的dsRNA可通过激活PKR而抑制K562细胞的生长增殖,其机制是通过活化的PKR使蛋白合成启始因子eIF2a磷酸化,从而阻断细胞内蛋白合成的启动,及阻止细胞周期进程来实现.     

反义寡核苷酸对K562细胞增殖和端粒酶活性的影响

 目的　研究靶向封闭端粒酶反转录酶（hTERT）mRNA的反义硫代寡核苷酸（ASPSODN）对K562细胞目的基因的抑制及其对端粒酶活性及细胞增殖周期和凋亡的影响 。方法　ASPSODN转染到人类红白血病细胞株K562,采用MTT法、酶联免疫吸附（ELISA）法和流式细胞术（FCM）检测K562细胞的增殖、端粒酶活性、细胞凋亡和细胞周期的改变,RT-PCR检测hTERT mRNA的表达。结果　0.6 μmol／L的ASPSODN（0.42±0.16）能明显下调hTERT表达（P＜0.05）,端粒酶相对活性降至52 %;MTT法检测显示明显抑制K562细胞增殖活性;FCM显示细胞凋亡率为10.31 %,PI染色显示细胞被阻止在G1／G0期,S期及G2／M期的细胞减少,但无特征性的凋亡峰。结论　ASPSODN靶向 hTERT 能特异性抑制K562细胞hTERT mRNA的表达,明显下调端粒酶活性,抑制K562细胞增殖,并通过降低细胞的端粒酶活性而诱发细胞凋亡。     

siRNA靶向EDAG-1基因对K562细胞株生长的影响

背景与目的：胚胎发育相关基因-1（EDAG-1）是造血系统发育相关的新基因，定位于9q22。本研究探讨抑制EDAG-1基因的表达对白血病细胞株生长的影响及其机制。方法：将靶向EDAG-1基因的特异序列连接到逆转录病毒载体中，脂质体介导的重组质粒转染包装病毒细胞（PT67），收集细胞上清感染K562细胞株，经嘌呤霉素筛选稳定抑制EDAG-1基因表达的细胞株，RT-PCR检测EDAG-1基因的抑制情况，应用MTT、流式细胞仪检测转染细胞的增殖能力及细胞周期。结果：成功构建了靶向EDAG-1基因的逆转录病毒重组质粒，建立了抑制EDAG-1基因表达的K562细胞株。抑制EDAG-1基因表达的细胞株增殖速度、增殖指数（PI）、增殖活性（SPF）相应降低，其G0／G1期细胞比例明显升高。结论：EDAG-1基因的沉默可以抑制白血病细胞株的增殖，使其阻滞在G0／G1期，提示EDAG-1基因可能是白血病治疗的一个有效靶点。