K88抗原基因研究进展(文献综述)

K88抗原是存在于肠毒性大肠杆菌表面的一种伞毛蛋白质。借伞毛的作用,肠毒性大肠杆菌可以吸附到仔猪小肠上皮细胞粘膜上,并在那里增殖,分泌肠毒素,引起仔猪腹泻、死亡。K88抗原是由约50md的大质粒编码的,通过重组和突变技术,对它们的性质进行了研究。     

重组痘苗病毒介导的IL-2抗小鼠FBL-3细胞肿瘤的实验研究

观察了编码人白细胞介素２基因的重组痘苗病毒对小鼠接种ＦＢＬ－３红白血病细胞诱发肿瘤的治疗作用，野生型ＦＢＬ－３红白血病细胞接种Ｃ５７ＢＬ／６小鼠皮下，建立荷瘤模型，随机分组，分别局部注射ＩＬ－２ＶＶ、ＴＫＶＶ、重组ＩＬ－２、Ｈａｎｋ‘ｓ     

我国登革2型病毒prM-E基因与SFV病毒载体重组RNA的构建

目的：构建我国登革２型病毒４３株ｐｒＭ－Ｅ基因的甲病毒（Ｓｅｍｌｉｋｉ ｆｏｒｅｓｔ ｖｉｒｕｓ,ＳＦＶ）重组ＲＮＡ,为登革新型疫苗的研究奠定基础。方法：首先将含有多种稀有限制酶位点的接头插入ｐＳＦＶ载体的多克隆位点,再把ｐｒＭ－Ｅ基因克隆至该载体中。将获得的重组质粒ＤＮＡ经体外转录后,通过电穿孔法将其转录的ＲＮＡ产物导入宿主细胞,并采用间接免疫荧光法检测ｐｒＭ－Ｅ基因的表达。结果：已获得含多种酶位点的ｐＳＦＶ病毒载体,并且所构建的含ｐｒＭ－Ｅ基因的重组ｐＳＦＶ病毒ＲＮＡ,在宿主细胞中的表达产物可与登革２型病毒特异抗体起反应。结论：构建的含ｐｒＭ－Ｅ基因的重组ｐＳＦＶ病毒ＲＮＡ可表达我国登革２型病毒株的特异蛋白。     

重组质粒pMG611中K99和F41抗原基因在E．coli中表达条件的研究

本文通过ELISA方法测定了重组质粒pMG611在不同宿主和培养条件下，K99和F41菌毛抗原的表达水平。研究结果表明重组质粒pMG611在HB101和RRI宿主菌中较在C600宿主菌中表达更多的K99和F41菌毛抗原。实验中还探讨了培养基、温度和丙氨酸对两种菌毛抗原表达的影响。     

登革3型病毒NS1基因重组质粒DNA的构建及其免疫原性观察

目的：构建登革3型病毒NS1基因的真核重组表达质粒，观察其免疫原性，为登革新型疫苗的研究提供依据。方法：从感染鼠脑中提取登革3型病毒RNA，经RT－PCR获得NS1基因片段，然后将其克隆到真核表达载体中。用电穿孔法将重组质粒NDA转入COS7细胞，通过免疫荧光法检测外源基因在真核细胞中的表达，将重组质粒DNA免疫BALB／c小鼠，观察其免疫原性。结果：通过酶切鉴定和序列测定证实了NS1基因片段已经插入真核表达载体，用免疫荧光法证明转染了重组质粒的COS7细胞的胞浆中有特异荧光。重组质粒DNA免疫小鼠后可观察到诱发产生的细胞免疫应答。结论：含有登革3型病毒NS1基因的真核重组表达质粒可以在COS7细胞中进行表达，而且能够诱导小鼠产生细胞免疫应答。     

同源异形盒Gax基因重组腺病毒载体的构建及其鉴定

目的:构建同源异形盒Gax基因的复制缺陷型腺病毒载体,并对其是否重组成功进行鉴定。方法:采用两步CaC l2转化法的DNA细菌内同源重组技术,PCR扩增小鼠Gax基因,将Gax基因克隆于腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV,转染含有5型腺病毒骨架质粒pAdeasy-1(33.5 kb)的B J5183细菌,经细菌内同源重组产生携带Gax基因的重组腺病毒载体pAd-Gax,经限制性内切酶BstⅨ和PacⅠ鉴定正确后,用脂质体法转染293细胞,包装产生携带Gax基因的重组腺病毒Ad-Gax。利用GFP的表达鉴定Ad-Gax。结果:构建了表达Gax基因的复制缺陷型腺病毒,病毒滴度达4×1010pfu/L。结论:成功地构建了表达Gax基因的复制缺陷型腺病毒载体,为进一步研究Gax基因在心血管病中的作用提供了实验基础。     

人巨细胞病毒UL82基因重组质粒的构建及其在大肠杆菌中的表达

目的 :用基因工程技术克隆人巨细胞病毒 pp71蛋白基因 ,构建高效表达 pp71蛋白的工程菌。 方法 :在传代培养的人包皮成纤维细胞中接种人巨细胞病毒 (HCMV) ,待绝大多数的细胞出现了细胞病变效应后 ,用冻融法收获细胞 ,用PCR技术扩增目的基因 ,将基因片段插入表达载体pGEX 4T 1内 ,转化大肠杆菌DH5 α,TPTG诱导其表达。结果 :获得的工程菌所表达的 pp71蛋白大小约为 710 0 0 ,约占菌体总蛋白的 3 0 0 %。结论 :成功的构建了 pGEX/ pp71重组表达质粒 ,并在DH5 α 中高效表达出pp71蛋白 ,为下一步pp71蛋白的大量表达和纯化奠定了基础。     

SP110基因过表达慢病毒载体的构建与包装

目的 构建核体蛋白SP110基因过表达慢病毒载体,并进行慢病毒包装,为研究SP110在结核病中的作用机制奠定基础。方法 利用PCR技术获得SP110基因序列并将其插入到慢病毒穿梭质粒LV5中,获得重组慢病毒质粒V-SP110,经酶切鉴定及DNA测序鉴定后,用RNAi-Mate将重组质粒和慢病毒包装质粒系统(pGag/Pol、pRev、pVSV-G)包装成重组慢病毒颗粒,共转染293T细胞,包装产生慢病毒。通过荧光显微镜或FACS计数荧光细胞,结合稀释倍数计算病毒滴度。结果 酶切鉴定结果显示产生约1 650 bp的片段,片段大小与SP110基因cDNA大小一致。DNA测序比对测序结果与预期SP110基因序列完全一致,说明SP110基因正确插入载体中,成功构建了SP110基因过表达载体。经293T细胞包装后,成功获得病毒滴度为1.0×108 TU/mL的重组慢病毒LV5-SP110。结论 SP110基因过表达慢病毒载体构建与包装成功完成,为进一步探讨SP110基因在结核病发生发展中的作用提供工具。     

人血管内皮生长因子-D的重组腺病毒制备与鉴定

生物旁路是近年来缺血性心脏病治疗研究的一个新热点。本研究旨在构建人血管内皮生长因子－Ｄ重组腺病毒,为基因转染研究所准备。用重组粘粒和ＤＮＡ－ＴＰＣ混合后,以磷酸钙共沉淀法转染２９３细胞,获取重组腺病毒。重组粘粒插入方向及重组腺病毒均经酶切鉴定为正确。所得重组腺病毒为Ｅ１缺陷,可用于体内基因治疗研究。     

HCVC区、E1区基因腺病毒表达载体骨架质粒pAd·HCV—CE1的构建、鉴定及表达

用分别含有BglⅡ及HindⅢ酶切位点的HCVCE1基因上、下游引物,以含有HCVH株基因序列的质粒pBRTM/HCV1-3011为模板,通过PCR扩增获得HCVCE1基因片段,定向插入到腺病毒骨架质粒pAd.CMV-Link1中CMV启动子下游BglⅡ与HindⅢ位点之间,获得重组表达质粒pAd.HCV-CE1。通过BgiⅡ/HindⅢ双酶切、PCR及插入片段序列测定对质粒进行鉴定,证实了pAd.HCV-CE1插入片段为HCVCE1区基因片段,以抗HCVC单克隆抗体为一抗,利用间接免疫荧光法证实 pAd.HCV-CE1可以在人肝癌细胞7721中瞬时表达。以上结果初步表明,构建的质粒pAd.HCV-CE1可以表达HCVCE1区基因,为进一步包装能高效表达HCVCE1基因的腺病毒载体奠定了基础。     

Human monoclonal antibody99mTc-88BV59: Detection of colorectal cancer, recurrent or metastatic disease and immunogenicity assessment

This study presents immunoscintigraphic results in 24 patients suffering from primary colorectal cancer, recurrent or metastatic disease after the injection of 1197–1351 MBq technetium-99m labelled totally human monoclonal antibody 88BV59. Labelling efficacy of^99mTc-88BV59 ranged from 97% to 99%. Immunoscintigraphy was performed 18–20 h after injection. Scintigraphic findings were compared with those of computed tomography (CT). Patients underwent surgery in order to evaluate immunoscintigraphic findings histologically. Sera of the patients (before injection and 1 and 3 months post infusion) were analysed for the presence of human anti-human antibodies (HAHA). None of the patients showed a HAHA response as assessed by a solid-phase ELISA assay. The antibody scan detected about 25% more lesions than CT. In the detection of extrahepatic disease, the sensitivity of the antibody scan proved to be 68%, whereas the sensitivity of CT was 41%.     

HBV全基因核心蛋白变异株稳定表达载体的构建及其抗原表达

通过定点突变技术将HBV质粒p3．8Ⅱ构建成核心蛋白变异株V60和L97。经序列测定和生物学活性检测后，亚克隆入EB病毒稳定表达载体。重组载体分别作内切酶酶切鉴定和序列测定证实，用脂质体介导转染HepG2细胞稳定传代，定量测定各株培养上清HBV抗原表达。结果发现，3株HBsAg含量S／N值接近，变异株HBeAg含量S／CO值低于野生株。上述3种重组载体的构建可为体外研究HBV核心蛋白热点变异与致病的关系提供基础。     

rhIL-11联合rhG-CSF和CTX动员小鼠外周造血干/祖细胞的实验研究

为研究rhIL 11联合rhG CSF和CTX对C5 7BL/ 6小鼠外周造血干细胞的动员作用 ,将 48只C5 7BL/ 6小鼠随机分为 4组 ,3组d0给予一次腹腔注射 2 0 0mg/kg的CTX ,其中 2组d1d15分别皮下注射rhIL 11、rhIL 11加rhG CSF ,观察不同时间外周血白细胞、血小板计数、CD34 细胞比例、CFU GM、CFU MK及CFU E的数量变化。结果发现 ,rhIL 11或联合rhG CSF可明显促进CTX骨髓抑制小鼠外周血血小板和白细胞的恢复、提高外周血CD34 细胞比例及三系造血细胞集落数量。证明rhIL 11具有外周血造血干细胞动员作用 ,而与rhG CSF和CTX联合动员效果更佳。     

胃癌组织中增殖细胞核抗原、P53、K-ras及Bcl-2蛋白的表达

为了解胃癌组织中多种基因蛋白异常表达及意义，应用免疫组化技术检测５１例手术切除胃癌组织标本中增殖细胞核抗原及Ｐ５３、Ｋ－ｒａｓ、Ｂｃｌ－２蛋白的表达。     

人CD34抗原胞外区cDNA的克隆、真核表达载体的构建及在基因免疫制备CD34单克隆抗体中的初步应用

目的 克隆含编码人CD34抗原胞外区的cDNA，并构建其真核表达载体，探讨基因免疫制备抗人CD34单克隆抗体的可行性。方法 从KG-1a细胞提取总RNA，RT-PCR扩增含编码人CD34抗原胞外区的cDNA并酶切测序鉴定。构建其真核表达载体pcDNA3.1-CD34。选取4～6周龄的BALB/c小鼠12只，随机分为3组，预先在股四头肌注射25％的蔗糖溶液50μl，然后在相同部位分别注射PBS空白对照、PBS稀释的空载体pcDNA3．1以及PBS稀释的pcDNA3．1-CD34，每2周1次共3次。免疫结束后定期FACS检测鼠尾静脉血抗人CD34抗体产生情况。结果 所扩增的人CD34抗原胞外区cDNA全长886bp，扩增片段大小与理论值相符，测序结果与文献报道完全一致，并且在5′端引入HindⅢ酶切位点，3′端引入EcoRI酶切位点及终止密码TGA。随后将其定向插入真核表达载体pCDNA3．1中，称之为pcDNA3．1-CD34，经阳性克隆筛选、酶切鉴定证实pcDNA3．1-CD34真核表达载体构建成功。FACS检测结果表明，用pcDNA3．1-CD34真核表达载体免疫的小鼠中仅1/4只在免疫结束后的第2～6周有较低滴度的CD34抗体产生，其余3只血清中均未检测到CD34抗体。结论 成功地构建了人CD34抗原胞外区cDNA的真核表达载体pcDNA3．1-CD34，初步证明用其进行基因免疫制备CD34单克隆抗体是可行性的。