2-DG通过内质网应激增强人卵巢癌SKOV3细胞顺铂敏感性的研究

目的:顺铂作为传统的化疗药物被广泛应用于临床,但其较强的副作用限制了顺铂的临床应用。为了提高肿瘤细胞对顺铂的敏感,我们选择2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)进行细胞实验。方法:利用免疫荧光结合免疫印迹技术检测2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)体外抗卵巢癌SKOV3细胞的抗肿瘤作用。结果:2-DG可增强顺铂对卵巢癌SKOV3细胞的抗肿瘤作用,包括抑制SKOV3细胞的增殖、诱导凋亡小体的形成和促进细胞的凋亡。免疫荧光结合免疫印迹技术检测显示,2-DG增强了顺铂诱导的SKOV3细胞内质网应激相关蛋白--葡萄糖调节蛋白78(GRP78)的表达;2-DG还上调顺铂诱导的SKOV3细胞内质网应激相关蛋白--凋亡蛋白153/C/EBP同源蛋白(CHOP)的表达。结论:2-DG通过增强顺铂诱导的内质网应激增加SKOV3细胞对顺铂的敏感性。     

小鼠未受精卵和早1-细胞期受精卵中MPF蛋白水平的检测

目的::检测小鼠未受精卵和早1-细胞期受精卵中M期促进因子(MPF)蛋白水平,探讨MPF在早1-细胞期受精卵中的变化.方法:利用超排卵及反复冻融裂解细胞的方法,对卵母细胞和受精卵细胞中MPF的催化亚基Cdc2、调节亚基周期素B进行Western印迹分析.结果:在500个MⅡ卵母细胞和受精卵细胞样品中,可以清楚看到各有一条粉紫色的特异免疫印迹带显示Cdc2,根据凝胶成像及分析系统的Gelworks应用软件分析,得到的强度的相对值分别是100%和约80%.用700个卵细胞进行观察时可以看到MⅡ卵母细胞显示有2条免疫印迹带显示细胞周期素B,其中一条为60～63 kDa,是周期素B;另一条则位于周期素B的下方,约40～45 kDa,且色调偏淡.而受精卵细胞样品在相应的部位则未能见到特异的免疫印迹带.结论:小鼠早1-细胞期受精卵(G1期)中的Cdc2蛋白水平仍保持在相对的较高水平;而细胞周期素B的量显著减少,难以检测.     

HRP-SPA免疫组化法检测抗核抗体和抗着丝点抗体

目的 :建立一种简单、方便、准确、特异的方法检测抗核抗体 ( ANA)及抗着丝点抗体( ACA)。方法 :比较 HRP- SPA免疫组化法与间接免疫荧光法。结果 :对 5 0例系统性红斑狼疮( SLE)、2 0例系统性硬皮病 ( PSS)患者血清进行 ANA及 ACA检测 ,两种方法检测 ANA阳性率基本相同 ,核型略有差异。 HRP- SPA免疫组化法检测 ANA正常值滴度定为≤ 1∶ 80 ,间接免疫荧光法正常值滴度定为≤ 1∶ 40。HRP- SPA免疫组化法检测 ACA的阳性率高于间接免疫荧光法 ,正常值滴度与 ANA相同。结论 :HRP- SPA免疫组化法完全可以取代间接免疫荧光法进行 ANA和ACA检测 ,是一种适用于基层医疗单位筛选风湿病的简单快捷的检验技术。     

Smad核相互作用蛋白1在白细胞介素-1β诱导骨关节炎中的作用及机制实验研究

目的:探究Smad核相互作用蛋白1(SNIP1)在白细胞介素-1β(IL-1β)诱导骨关节炎中的作用及机制.方法:不同浓度IL-1β处理NHAC-κn细胞24 h后,用CCK-8检测细胞活性.逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和免疫印迹分析法检测SNIP1在骨关节炎细胞模型中的表达.ELISA和免疫印迹分析法检测炎症...     

增强型绿色荧光蛋白兔多克隆抗体的制备

目的:制备增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的兔多克隆抗体.方法:用谷胱甘肽-增强型绿色荧光蛋白(GST-EGFP)融合抗原加福氏完全佐剂背部皮内注射首次免疫新西兰大白兔,第28天用GST-EGFP融合抗原加福氏不完全佐剂同样剂量加强免疫,第35天时再次免疫.第49天心脏采血30 mL,4℃静置过夜,收集血清,用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗血清中EGFP多克隆抗体的效价;免疫印迹法检测EGFP多克隆抗体的特异性;利用荧光免疫细胞化学检测该抗体和观察转染EGFP贴壁生长的大鼠脑皮层混合培养细胞中EGFP的表达.结果:ELISA检测EGFP多克隆抗体滴度最高为1:9 549;免疫印迹检测结果显示该抗体特异性高;荧光免疫细胞化学检测显示存混合培养细胞中EGFP呈阳性表达.结论:直接使用GST-EGFP融合蛋白免疫新西兰大白兔,可在较短时间内制备大量EGFP多克隆抗体.     

富组蛋白-5表达质粒构建及抗菌功能研究

目的 构建富组蛋白-5(histidine-rich protein-5,HRP-5)重组表达载体,表达并纯化HRP-5蛋白,观察其抗菌作用.方法 用基因克隆的方法构建pET-32a-HRP-5重组表达质粒,经IPTG诱导表达后,用亲和层析的方法纯化HRP-5融合蛋白,Tricine-SDS-PAGE电泳鉴定其分子量,琼脂糖弥散法检测其抗菌功能.结果 成功构建了pET-32a-HRP-5表达质粒并表达、纯化出HRP-5融合蛋白,融合蛋白对致病性大肠杆菌54299和绿脓杆菌PAO1有抗菌活性.结论 HRP-5是一种抗菌分子,参与了机体的天然免疫防御功能.     

ADAMTS-2及TGF-β1在肝硬化组织中的表达

目的:检测含Ⅰ型凝血酶敏感蛋白模体的解整合素样金属蛋白酶(a disintegrin and metalloprotease withthrombospondin motif, ADAMTS)-2 及转化生长因子(transforming growth factor, TGF)-β1 在肝硬化组织中的表达, 探讨ADAMTS-2 与TGF-β1 在肝硬化发生和发展中的作用。方法:收集武汉总医院2010 年3 月至6 月肝硬化门静脉高压症患者的肝组织16 例及外伤性肝破裂正常肝组织8 例作为正常对照组。采用免疫组织化学及Western 印迹法检测ADAMTS-2 及TGF-β1 在肝硬化组织及正常组织中的表达。结果:免疫组织化学结果显示肝硬化组织中ADAMTS-2和TGF-β1 表达较正常肝组织明显增高(P<0.05)。Western 印迹分析亦显示ADAMTS-2 及TGF-β1 在肝硬化组织中表达强度明显高于正常组织(P<0.05), 而且两者的表达呈正相关(r=0.862, P<0.01)。结论:ADAMTS-2 和TGF-β1 可能存在协同致肝纤维化作用。     

雷帕霉素协同去甲氧柔红霉素诱导人急性T淋巴细胞白血病Jurkat细胞株凋亡的作用

目的:探讨去甲氧柔红霉素( idarubicin,IDA)联合雷帕霉素(rapamycin,Rapa)抗人急性T淋巴细胞白血病(T-ALL) Jurkat细胞株的效应及机制.方法:应用CCK-8法分析两药联用对细胞增殖的影响;Isobologram法分析两药联合作用的性质;电镜形态学观察和Annexin V/PI染色流式细胞仪检测细胞凋亡情况;免疫印迹法检测凋亡相关基因Caspase3、PARP、Caspase8、Caspase9及Akt、p-Akt、P85S6K、p-P85S6K、P70S6K、p-P7OS6K、ERK1/2、p-ERK1/2等蛋白质水平表达.结果:CCK-8法示IDA联合Rapa能明显降低IDA的半数抑制浓度(50% inhibition concentration,IC50)值.Isobologram法示两药联合指数小于1.免疫印迹法示两药联用组较IDA单用组更能激活Caspase3和底物PARP,Caspase8和Caspase9在两药联用组均呈现明显激活.IDA联用Rapa后能使mTOR 信号通路上游的Akt及下游的P85S6K、P70S6K分子磷酸化水平明显降低,并能协同下调ERK的磷酸化水平.结论:Rapa和IDA对Jurkat细胞的生长抑制具有协同作用,两药联用时细胞凋亡增加,且通过线粒体和细胞膜双途径增强凋亡效应.其协同机制可能与Rapa逆转IDA引起的Akt/mTOR信号通路激活,并抑制ERK信号活化有关.     

酶标抗体与酶标葡萄球菌A蛋白在ELISA中检测病毒抗体的比较

用酶标抗体(HRP-抗人IgG)与酶标葡萄球菌A蛋白(HRP-SPA)作ELISA检测临床疑似乙脑病人单份血清91份,及临床诊断疑似腺病毒感染病人单份血清63份,7例双份血清14份的结果,两种方法都有较高敏感性与特异性。HRP-SPA敏感性较HRP-抗人IgG低,而HRP-SPA非特异性反应较少,且制备简单,比较稳定,一种HRP-SPA可以检测多种动物血清,有可能替代HRP-抗人IgG在FLISA中应用。     

AMY1基因编码α淀粉酶在体外培养大鼠颌下腺细胞中的表达

目的:检测大鼠颌下腺(SMG)AMY1基因编码α淀粉酶(α-Amy)在体外培养颌下腺细胞中的表达,鉴定细胞来源和检测体外培养细胞的功能。方法:分别进行培养大鼠细胞RT-PCR检测淀粉酶的基因表达;免疫印迹法(Western blotting)检测淀粉酶蛋白质。结果:大鼠SMG组织和培养细胞检测在474bp处显示有一相同的带。表明大鼠培养SMG细胞RT-PCR产物与大鼠SMG组织α-淀粉酶mRNA表达相同。免疫印迹结果显示大鼠SMG组织与培养细胞分别出现了一单独的α-淀粉酶免疫活性蛋白电泳带,其分子大小为50kDa,两者免疫活性蛋白泳带一致。结论:大鼠SMG组织和培养细胞淀粉酶mRNA表达相同,大鼠培养SMG细胞与大鼠SMG组织具有同源性。体外培养SMG细胞通过AMY1基因编码α-淀粉酶表达。     

一种新的ELISA无毒底物TMBS在血清结核菌抗原检测中的应用

通过实验室操作,介绍3,3,5,5,一四甲基联苯胺硫酸盐(TMBS)作为ELISA底物,应用于血清结核抗原的检测;TMBS的主要优点是无致癌性,敏感性高,显色结果终止后稳定。通过实验确定了TMBS在ELISA中的最佳反应条件;经试用于Ⅲ例各种结核病人血清结核抗原检测,结果敏感性是目前最常用的底物邻苯二胺(OPD)的2.3倍,阳性检出率增加10.81%差异显著(P<0.05)。     

用三种逆转录PCR扩增系统检测丙型肝炎病毒RNA的比较

目的：比较常用的三种（ＭＭＬＶ／Ｔａｑ，ＡＭＶ／Ｔａｑ和Ｔｔｈ单酶）逆转录ＰＣＲ扩增系统的效果。方法：利用这三个系统对丙型肝炎病毒不同稀释度ＲＮＡ进行逆转录ＰＣＲ扩增，比较其检测灵敏度。结果：ＡＭＶ／Ｔａｑ系统最佳，ＭＭＬＶ／Ｔａｑ系统次之，Ｔｔｈ单酶系统最差，ＡＭＶ／Ｔａｑ系统的检测灵敏度比Ｔｒｈ单酶系统高１００００倍，比ＭＭＬＶ／Ｔａｑ系统高１００倍。结论：建议使用ＡＭＶ／Ｔａｑ酶的逆转录ＰＣＲ扩增系统以提高丙型肝炎病毒的检测灵敏度，减少假阴性的出现。     

双单抗夹心ELISA法检测脑囊尾蚴病血清特异性免疫复合物

目的 :建立双单抗夹心酶联免疫吸附试验法检测脑囊尾蚴病患者血清中特异性免疫复合物。方法 :用抗人IgG单抗包被 ,捕获血清中特异性IgG型免疫复合物 ,通过酶标抗囊尾蚴单抗结合物显色 ,测其OD值。结果 :用本方法测得患者特异性免疫复合物阳性率为 5 3.3 % ,明显高于正常对照组 (P <0 .0 0 5 ) ;循环抗原、抗体皆阴性患者 ,免疫复合物的阳性率为 5 0 % ,与各组相比差异有显著性 (P <0 .0 0 5 ) ;且免疫复合物的检出率明显高于循环抗原的检出率 (P <0 .0 0 5 )。结论 :本法对囊尾蚴病的诊断有重要的临床价值 ,尤其对抗原、抗体皆阴性患者意义更大     

胶体金层析法检测恶性疟原虫HRPII抗原的应用研究

目的 :建立一种简易快速 ,适于基层或流行病学调查的自测式胶体金免疫层析法 (GICA)用于检测恶性疟原虫中 H RPII抗原 ,判定是否现症感染。方法 :用 GICA测试条检测全血及滤纸血样中的 H RPII抗原。结果 :40例恶性疟全血及滤纸血 H RPII抗原阳性检出率均为 1 0 0 ,与镜检结果相符合 ;2 5例间日疟均为阴性。结论 :GICA检测血中恶性疟原虫 H RPII抗原特异性强、灵敏度高、简便快速 ,无需特殊仪器设备 ,滤纸血的应用使样本的采集、保存和运输更为便利 ,适合大规模流行病学调查和基层使用 ,有广泛应用价值。     

ELISA检测IL-1α的实验优化研究

目的:研究酶联免疫吸附试验(ELISA)检测白细胞介素1(IL-1α)的最佳试验条件,用优化配制的TMB/HRP显色体系最大程度降低成本,可适用于多数ELISA测定。方法:以前期优化方案为基础,进一步对抗体包被时间、包被温度、显色液配制等条件的优化,检测IL-1α标准品OD值并进行结果比较。结果:抗体包被于室温24h,最优显色体系为按四甲基联苯胺(TMB)终浓度0.1mg/mL和0.03%H2O2配制,可获得最佳IL-1α定量结果。结论:用优化后的ELISA方法测定IL-1α的敏感性、重复性及标准曲线拟合度更佳,具有良好的应用前景。     

类弹性蛋白展示NT-proBNP双抗原表位重组蛋白的制备和纯化

目的：利用大肠杆菌（E.coli）高效制备类弹性蛋白（ELP）展示N端脑钠肽前体（NT-proBNP）双抗原表位的重组蛋白,为低成本、高效地制备NT-proBNP检测校准品提供依据。方法：分别设计NT-proBNP第13~20位和第63~71位氨基酸残基表位,通过柔链连接上述2个抗原表位与ELP融合,获得3种融合蛋白。利用基因工程技术合成编码以上3种融合蛋白的基因并克隆到pET-28a （+）载体上,转入E.coli BL21（DE3）自动诱导表达,利用多次可逆相变循环（ITC）纯化重组蛋白,并应用Western blotting和ELISA法检测其抗体特异结合表位的能力。结果：成功构建了3种ELP展示NT-proBNP抗原表位的载体,并在E.coli中表达获得相应重组蛋白。Western blotting和直接ELISA检测,ELP展示的特异抗原表位均具有良好的与相应抗体结合的能力。夹心ELISA法检测,ELP展示NT-proBNP双抗原表位重组蛋白的蛋白浓度与450 nm处吸光度（A）值呈双对数线性剂量依赖关系（r=0.9197,P<0.01）。结论：成功利用ELP展示NF-proBNP双抗原表位,为低成本、高效地制备出与NT-proBNP检测校准品奠定了基础。     

生物样本中过氧化脂质定量测定的三种方法比较

目的　探讨在生物样本体系中测定过氧化脂质 (L PO)的较理想方法。方法　用目前最常用的 FOX法 ,改进碘量法 ,TBARS法同时测定不同生物样本体系中的 L PO浓度 ,并以线型性 ,准确度 ,精确度 ,稳定性和检测效率等指标评估、比较此三种方法的优劣。样本体系包括萃取的低密度脂蛋白 (L DL) ,细胞培养上清液 ,人血浆。结果　在萃取的 L DL样本体系中 ,FOX法显示出对 L PO最敏感的检测效率 ,并具有良好的准确性和精确度。但在细胞培养上清液和人血浆中 ,改进碘量法和 TBARS法的质量评估指标则优于 FOX法。在准确度评估实验中 ,FOX法对人血浆中的加样回收率明显偏低 (6 1.92 %± 2 .92 % ,碘量法 99.0 0 %± 2 .6 5 % ,TBARS法 10 1.6 3%±12 .0 0 % ) ,重复性也差 (评估精确度的变异系数 CV:FOX法为 19.15 % ,碘量法 4 .36 % ,TBARS法 3.14 % )。在线型性评估和稳定性评估实验中 ,三种方法皆显示出良好的性能。在人血浆中 L PO浓度的测值 ,改进碘量法为(14 .189± 4 .889)μm ol/ L ,TBARS法为 (0 .936± 0 .4 6 2 )μmol/ L ,上述测值与其它作者的报道相近。结论　在相对纯净的样本体系中 ,FOX法显示出对 L PO最敏感的检测效能。但在复杂样本体系中 ,改进碘量法和 TBARS法测定 L PO的各项质量指标则优于 FOX     

肼化辣根过氧化物酶糖蛋白染色法

探索一种简便灵敏的糖蛋白半定量法。在 ｐＨ ５．０，碳二亚胺（ＥＤＣ）催化下，辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）与己二酰二肼反应生成肼化的ＨＲＰ（ＨＲＰ－ＨＺ），固相于硝酸纤维素膜上的糖蛋白（纤连蛋白或转铁蛋白）经过碘酸氧化其糖链中的糖基后生成的醛基可与ＨＲＰ—ＨＺ缩合，用ＨＲＰ的发包底物显色即可检出精蛋白的存在与否。结果：糖蛋白中，１０ ｎｇ的糖即可被检出。结论：与其他糖定量方法相比，该方法灵敏度高，方法简便，能够普遍应用。     

壳聚糖作为敏感膜材料的研究

以壳聚糖为膜材料制成薄膜 ,运用生物素 -亲和素系统将辣根过氧化物酶 (HRP)固定在膜上 ,固定化过程对 HRP的活性无影响 ,而其稳定性提高 ,运用 L uminol- H2 O2 - HRP化学发光体系 ,对水样中微量 H2 O2 进行检测 ,在 10 - 6～ 10 - 9m ol/ L 范围内线性关系良好 ,回归方程 :Y=2 0 .6 48X- 2 15 .2 39(X:nm ol/ L) ,检测灵敏度为 0 .5 nmol/ L。实验研制的壳聚糖膜可制成生物传感器多功能敏感膜     

壳聚糖/碳纳米管修饰电极电化学免疫传感器用于甲胎蛋白检测

目的构建壳聚糖/碳纳米管(CNT)修饰电极电化学免疫传感器用于甲胎蛋白(AFP)检测的新技术。方法采用壳聚糖/CNT复合物修饰玻碳电极,通过共价键合方式将AFP抗体固定在修饰电极表面,固定抗体的电极与AFP、辣根过氧化物酶(HRP)标记的AFP抗体反应,构筑夹心型免疫复合结构。HRP催化TMB底物产生电流信号,电流信号大小与AFP浓度成正相关,实现对AFP的高灵敏检测。结果该电化学免疫传感器可以准确检测AFP标准样品,也可用于检测血清中AFP的浓度。结论壳聚糖/CNT修饰电极构建的用于AFP检测的电化学免疫传感器具有较高的灵敏度和准确性。