内皮祖细胞磁性标记及MR示踪在大鼠脑胶质瘤血管生成研究中的应用

目的探讨内皮祖细胞磁性标记及磁共振成像(MR)示踪在大鼠脑胶质瘤血管生成研究中的应用。方法通过C6胶质瘤细胞株系定位注射建立大鼠脑胶质瘤模型。结果未磁性标记的内皮祖细胞T2*map序列下肿瘤区见线状针道信号,肿瘤组织在T2*map序列未见明显异常的信号,而磁性标记的内皮祖细胞T2WI和T2*map扫描下发现瘤周异于针道信号的间断线状低信号,并可见信号变弱的趋势,迁移后的内皮祖细胞在血管生成处定位。结论 USPIO对于内皮祖细胞磁性标记和MR示踪是一种有效的标记物,而MRI也是活体示踪观察USPIO标记脑胶质瘤血管生成的有效手段。     

硫化氢对内皮祖细胞数量和功能的影响

目的：观察不同浓度的硫化氢（H2s）对体外培养内皮祖细胞（EPCs）数量和功能的影响。方法：以密度梯度离心法获取脐血单个核细胞,培养6d后收集贴壁细胞。用流式细胞仪检测细胞表达CD34、CD133、血管内皮生长因子受体（VEGFR）2、VE—Cadherin,并用荧光显微镜观察细胞吞噬Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白（Dil-ac—LDL）和异硫氰酸荧光素-荆豆凝集素-1（FITC—UEA-1）来鉴定EPCs。以不同浓度的H2S（0、10μM、50μM、100μM或500μM）孵育EPCs（每天1h）,分别培养4d观察细胞集落及6dEPCs数量。结果：与正常对照组相比,H2S在一定浓度下（〈100μM）呈浓度依赖性促进EPCs增殖及细胞集落形成（P〈0．05）。结论：一定浓度的硫化氢可能通过抗氧化发挥对内皮祖细胞的影响。     

不同浓度超顺磁性氧化铁纳米粒子对小鼠RAW264．7巨噬细胞的影响

目的 评价不同浓度超顺磁性氧化铁纳米粒子（superparamagnetic iron oxides,SPIO）对小鼠RAW264.7巨噬细胞的细胞活性及吞噬功能的影响.方法 常规方法培养小鼠RAW264.7巨噬细胞,应用不同浓度SPIO（0 μg/ml、14μg/ml、28μg/ml、56μg/ml、84μg/ml、140μg/ml、280μg/ml、560μg/ml、840μg/ml）标记小鼠RAW264.7巨噬细胞,采用普鲁士蓝染色检测细胞标记率,台盼蓝染色检测细胞活性,四唑盐（MTT）比色实验检测细胞增殖能力,中性红吞噬实验检测细胞吞噬功能.结果 SPIO含铁浓度84 μg/ml标记24小时,细胞标记率可以达到100%;以后随SPIO浓度的增加,细胞内吞噬的铁颗粒增加,当SPIO含铁浓度为280 μg/ml时,细胞内吞噬铁颗粒达到饱和;当SPIO含铁浓度大于280 μg/ml时,细胞活性下降,吞噬能力降低;当SPIO含铁浓度大于140 μg/ml时,细胞增殖能力下降.结论 SPIO含铁浓度为（84～140）μg/ml标记24h,细胞的标记率为100%并且不影响细胞活性、细胞增殖能力及吞噬能力.     

EPCs在肝癌模型中的分布及其对肝癌形成的影响

目的:探讨内皮祖细胞(EPCs)在大鼠肝癌模型形成中的作用.方法:分离培养大鼠EPCs,体外用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)标记后,将EPCs-DAPI制成1×105/150 uL,2×105/150 μL,4×105/150uL的低、中、高浓度悬液,模型组和EPCs移植组的SD大鼠腹腔注射二乙基亚硝胺(D...     

外周血内皮祖细胞磁探针标记及体外磁共振成像的实验研究

目的应用纳米磁探针三氧化二铁（Fe2O3）-多聚赖氨酸（PLL）复合物体外标记兔外周血内皮祖细胞（EPCs）,磁共振（MR）对标记细胞成像。方法合成Fe2O3-PLL复合物。分离兔外周血单个核细胞,贴壁法筛选出EPCs,传代培养,Fe2O3-PLL标记祖细胞,普鲁士蓝染色、电子显微镜显示细胞内铁,四氮噻唑蓝（MTT）比色试验评价不同浓度Fe2O3-PLL标记EPCs后对细胞生长状况的影响,流式细胞分析检测标记、未标记细胞的细胞周期、细胞凋亡,应用MR的不同序列进行细胞群成像。结果普鲁士蓝染色、电镜观察均可见铁颗粒位于细胞质内,标记率接近100％,MTT比色试验示10μg／ml至200μg／ml7个铁浓度组,Fe2O3-PLL标记后细胞的光吸收值与未标记者比较,差异无统计学意义,流式细胞分析结果显示Fe2O3-PLL标记后细胞周期、细胞凋亡与未标记细胞间差异无统计学意义。磁共振成像（MRI）显示标记Fe2O3-PLL的细胞群较未标记者信号降低,以T2^＋加权像（FWI）信号强度变化率最大;标记后7d的信号强度变化率均较标记1d者下降。结论Fe2O3-PLL可以有效标记兔外周血EPCs,其对细胞的活力、增殖等生物学特性无明显影响。临床应用型1．5TMR可在体外进行标记细胞群成像,间接反映于细胞的数量和分裂增殖状态。     

细胞磁共振成像不能区分磁标细胞的存活状态

目的探讨不同状态下磁标记间充质干细胞(MSCs)的体内外磁共振(MR)成像特点,明确MR对细胞存活状态是否有鉴别诊断价值。方法分离培养猪骨髓MSCs,用超顺磁性铁纳米颗粒(SPIO)标记细胞24h。对未标记MSCs、存活的SPIO-MSCs、死亡的SPIO-MSCs、单纯SPIO进行体外凝胶内1.5TMR成像;开胸结扎前降支建立猪心肌梗死模型,于梗死交界区心肌内直接注射未标记MSCs、存活的SPIO-MSCs、死亡的SPIO-MSCs和单纯SPIO,然后进行体内T2*WI-flash序列MR成像。结果存活的SPIO-MSCs、死亡的SPIO-MSCs和单纯SPIO在体内外T2*WI-flash序列MR图像上均显示为低信号区,单凭图像无法区分。结论细胞MR成像无法区分组织磁标细胞、游离铁和含铁病变,因此对长期细胞示踪结果的解读应该慎重。     

内皮祖细胞促动脉内皮损伤修复的研究

目的评价骨髓源性内皮祖细胞(progenitor endothelial cells,EPCs)移植促动脉损伤内皮修复的效果。方法将菲立磁(superparam agnetic iron oxide,SPIO)和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)双标记的EPC局部注入损伤颈动脉段腔内。术后1d、7d和28d行磁共振(magnetic resonance imaging,MRI)扫描、组织学检查及内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)检测。结果MRI扫描发现移植部位出现低信号区。移植组HE、普鲁士蓝、vWF免疫组化染色、GFP荧光、偶氮蓝(Evans blue)染色均提示EPC可粘附于内膜损伤处,并随时间分化为内皮细胞;同时eNOS表达随时间变化而增多。结论菲立磁标记内皮祖细胞可促进动脉损伤内皮的修复,并可为MRI示踪。     

小型猪骨髓间充质干细胞超顺磁氧化铁、增强型绿色荧光蛋白双标记及体外磁共振成像示踪的研究

目的 探讨超顺磁氧化铁(SPIO)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)体外双标记、磁共振成像(MRI)示踪1型糖尿病(T1DM)小型猪骨髓间充质干细胞(BMSCs)的可行性和标记方法.方法 采集T1DM小型猪骨髓,密度梯度离心和贴壁培养法分离BMSCs.选用携带EGFP慢病毒(LV)颗粒转染BMSCs.选用SPIO和左旋多聚赖氨酸(PLL)复合物标记LV-EGFP转染的BMSCs.对SPIO标记细胞进行普鲁士蓝染色、透射电镜观察和体外MRI.结果 LV-EGFP与BMSCs转染复数(MOI)为30∶1转染后96 h荧光表达最强,阳性转染率43.2%.Fe3+标记浓度为25 mg/L BMSCs阳性标记率93.1%.透射电镜检测发现,SPIO粒子密集于BMSCs细胞质,次级溶酶体内多见.MRI显示,Fe3+标记浓度为25 mg/L、1×104/ml细胞浓度标记后3周和6周在快速自旋回波序列(TSE)T1WI、TSET2WI及快速小角度激发成像(FLASH)T2*WI信号强度变化率(△SI)依次为12%、41%、63%和7%、28%、46%,均为后二者大于前者(分别P＜0.01和P＜0.05),提示SPIO该标记浓度和细胞密度标记后3周和6周在T2WI及T2*WI呈现较明显的信号变化.结论 采用体外EGFP和SPIO双重标记的方法,结合MRI和细胞化学染色法可以稳定地对T1DM小型猪BMSCs进行体外示踪.

Abstract：

Objectives To track bone marrow stem cells (BMSCs) labeled by enhanced green fluorescent protein (EGFP) and superparamagnetic iron oxide ( SPIO ) -poly-L-lysine (PLL) compound by MRI in vitro for autotransplantation into pancreas of type 1 diabetes miniature pigs. Methods The BMSCs were isolated by density gradient centrifugation and attachment culture from type 1 diabetes minipigs' bone marrow. Expressional intensity of EGFP in BMSCs transfected lentivirus-EGFP with a multiplicity of infection Different magnetic resonance scanning protocols were carried out on various density BMSCs labeled by different concentration of SPIO in various time-point in vitro. Results When SPIO concentration was 25mg/L (count in Fe3 + ), the positive Fe3+ -labeling rate of BMSCs was 93. 1%. Most of SPIO particles in BMSCs' cytoplasm were observed in secondary lysosomes, but they were not detected in important organelle as cell nucleus. Comparing with gelatin the MRI of BMSCs labeled with SPIO in the condition with 1 ×104/ml cells density and 25 mg/L Fe3+ concentration in vitro, the signal intensity changes (△SI) after BMSCs labeled with SPIO 3 weeks and 6 weeks in TSE T1WI, TSE T2WI and FLASH T2 * WI sequences were 12%, 41%, 63% and 7%, 28%, 46% respectively (P ＜ 0.01 and P ＜ 0.05, respectively).Conclusions The data showed that the porcine BMSCs labeled with SPIO and EGFP could be traced successfully in vitro by MRI in the suitable sequences.     

酸性成纤维细胞因子对下肢动脉硬化闭塞症患者内皮祖细胞的影响

目的 探讨酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)对下肢动脉硬化闭塞症(LEASD)患者外周血内皮祖细胞(EPCs)增殖与凋亡的影响.方法 选择LEASD患者36例,取外周血20 ml,获取单个核细胞,培养7d,细胞传至第3代,分为对照组,加aFGF 1、2和5 μg/L,依次为低、中、高浓度组,每组9例,各组干预6、12、...     

血流导向支架置人后内皮祖细胞对兔动脉瘤的促愈合作用

目的 探讨内皮祖细胞（EPCs）能否参与血流导向支架治疗动脉瘤的早期愈合过程.方法 选择清洁级大白兔5只,采用胰弹性酶制备右侧颈动脉动脉瘤模型.自体培养EPCs后,用Hoechst 33342和羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯（CFSE）进行双标记.利用血流导向支架治疗兔的动脉瘤,将标记的EPCs经静脉自体回输,2周后利用细胞示踪技术观察EPCs参与动脉瘤内膜的修复情况,结合扫描电镜、病理、免疫组化等方法分析EPCs参与内膜修复的过程.结果 ①单纯血流导向支架治疗后2周复查,动脉瘤完全不显影（5/5）,动脉瘤完全闭塞,瘤颈口覆盖新生内膜;②在2只实验动物（2/5）的动脉瘤切片中发现Hoechst 33342和CFSE双标记的阳性细胞,阳性细胞位于新生的内膜内;③扫描电镜及免疫组化结果提示,内膜面仅有少量内皮细胞修复内膜.结论 EPCs参与了动脉瘤的早期内膜愈合过程.     

磁探针标记人内皮型一氧化氮合酶基因修饰的内皮祖细胞及其体外磁共振成像实验研究

目的 人内皮型一氧化氮合酶(heNOS)基因体外修饰兔外周血来源的内皮祖细胞(EPC)后,应用纳米磁探针三氧化二铁(Fe2O3)-精氨酸(arginine)复合物体外标记基因修饰的EPC,磁共振(MR)进行标记细胞成像.方法 制备Fe2O3-arginine复合物.分离兔外周血单个核细胞,贴壁法筛选出EPC,传代培养,用脂质体LipofectamineTM2000体外转染heNOS基因至EPC,转染后48 h对基因修饰EPC进行磁探针标记,普鲁士蓝染色显示细胞内铁,Western blot检测heNOS基因表达情况,四氮噻唑蓝(MTT)比色试验评价磁探针标记基因修饰EPC后对细胞生长状况的影响,流式细胞分析检测标记、未标记细胞的凋亡,应用磁共振的T1WI、T2WI、T2*WI3个序列进行细胞群成像.结果 普鲁士蓝染色可见铁颗粒位于细胞质内,标记率与标记的未修饰基因组EPC相似,都接近100%.MTT比色试验示Fe2O3-arginine标记后3、4、5天,标记的基因修饰细胞组、未修饰基因细胞组的吸光度值与未标记者比较,差异无统计学意义.流式细胞分析结果 显示Fe2O3-arginine标记后细胞凋亡与未标记细胞间差异无统计学意义.磁共振成像显示标记的基因修饰细胞群信号强度的变化与标记的未修饰基因细胞相似,两者之间差异无统计学意义,且两者均较未标记细胞群信号低,以T2*WI的信号强度变化率最大,标记后7 d的信号强度变化率均较标记后1 d者下降.结论 使用脂质体可以成功地将外源heNOS基因转染进兔外周血EPC中并在某中有效表达,Fe2O3-arginine可以有效标记heNOS基因修饰的EPC,其对细胞的活力、增殖等生物学特性无明显影响.临床应用型1.5T MR可在体外进行标记细胞群成像,间接反映干细胞的数量和分裂增殖状态.     

小鼠脾源性内皮祖细胞培养及7.0T磁共振单细胞成像初探

目的 建立一种小鼠脾源性内皮祖细胞的培养方法,探讨7.0T磁共振(7.0T MR)系统对磁标记单细胞成像的可行性.方法 密度梯度离心法分离脾脏单个核细胞,诱导培养得到内皮祖细胞(EPC).免疫化学、荧光染色鉴定细胞特性.Fe_2O_3-PLL标记细胞,普鲁士蓝染色,MTT法评价Fe_2O_3-PLL对细胞生长的影响,邻菲啰啉法定量分析细胞内铁含量.7.0T MR不同序列体外单细胞成像.结果 小鼠脾脏单个核细胞经体外诱导培养呈内皮细胞形态,表达EPC表面标志物CD31、CD34、vWF,显示内吞乙酰化低密度脂蛋白(acLDL)、结合凝集素1(UEA-1)等内皮细胞的功能.MTT检测Fe_2O_3-PLL标记对细胞增殖活力影响不明显,标记组与未标记组吸光度(A)值比较第4天至第7天差异均无统计学意义(第4天,t=2.81;第5天,t=-1.87;第6天,t=-0.298;第7天,t=-0.115;P均＞0.05).磁标记单细胞能够在7.0T MR检测中成像,自旋回波序列(MSME)图像中标记细胞显示灰度高于梯度回波序列(2D-FLASH),MSME序列图像标记细胞平均导致信号缺失体素个数为20.2个,而2D-FLASH序列图像为30.1个,差异具有统计学意义(t=15.2,P＜0.05).结论 小鼠脾脏单个核细胞可诱导分化为EPC.在7.0T MR检测中Fe_2O_3-PLL标记的EPC能够实现体外单细胞成像.     

磁共振成像示踪观察脑缺血大鼠脑室内移植神经干细胞的实验研究

目的探讨MRI示踪观察脑缺血大鼠脑室内移植的标记神经干细胞的分布和迁移的可行性。方法选取16只雄性SD大鼠制做脑梗死模型,随机分为标记组和未标记组,每组8只,分别于脑梗死对侧侧脑室内立体定向移植超顺磁性氧化铁纳米颗粒标记和未经标记的神经干细胞。移植细胞后,不同时间点分别进行MRI连续成像观察,之后进行大鼠脑组织冷冻切片的普鲁士蓝染色。结果标记组移植后即刻的MRI即可观察到大鼠侧脑室内的移植标记细胞,移植后7天脑梗死皮质下即可见到低信号影,各对应时间点组织切片的普鲁士蓝染色与MRI结果相符。结论MRI能够在活体内连续无创的示踪观察大鼠侧脑室移植的标记神经干细胞的迁移及分布情况。     

Magnetic resonance evaluation of transplanted mesenchymal stem cells after myocardial infarction in swine

Objectives To trace and evaluate intracoronary transplanted mesenchymal stem cells(MSCs) labeled with superparamagnetic iron oxide(SPIO) by using magnetic resonance imaging(MRI) in a swine model of myocardial infarction (MI).Methods MSCs were transfected with a lentiviral vector carrying the gene encoding green fluorescent protein (GFP) and labeled in vitro with SPIO.Two weeks after MI, swine were randomized to intracoronary transplantation of dual -labeled MSCs(n = 10),MSCs-GFP(n = 10) and saline(n = 5).MRI examination was performed with a 1.5T clinical scanner at 24 hours,3 weeks and 8 weeks after cells transplantation. Signal intensity(SI) changes,cardiac function and MI size were measured using MRI.Correlation between MR findings and histomorphologic findings was also investigated. Results The labeling efficiency at a combination of 25μg Fe/ml SPIO and 0.8 pi/ml Lipofectamine 2000 reached 100%.SPIO labeling did not affect GFP fluorescence and dual-labeling did not affect cell proliferation(P>0.05). Multipotentiality was not affected especially for cardiomyocyte-like cells differentiation.Cardiac cell marker of a-MHC and actinin were positively expressed by immunofluorescence staining after induction.SI on T2 * WI decreased substantial- ly in the interventricular septum 24 hours after injection of MSCs.The intensity of hypo-intense signals appeared to increase throughout the later time points.Changes in SI at 24 hours,3 weeks and 8 weeks were 52.98%±10.74%,21.53%±5.40%and 6.23%±2.01%,respectively(P<0.01).DE-MRI demonstrated both dual-labeled MSCSs and MSCs-GFP could dramatically reduce the size of MI and improve cardiac function. Histological data revealed that prussian blue stain-positive cells were found mainly in the border zone which also showed green fluorescence but negative for macrophage marker(CD68).Gross pathologic examination revealed that engrafted MSCs dramatically reduce the extent of necrotic myocardium and promote the regeneration of new,contractile myocardium along the subendocardia     

动脉内注入内皮祖细胞促进血管内皮快速修复的实验研究

目的探讨体外培养的自体内皮祖细胞（EPC）对兔颈动脉球囊损伤后内皮修复以及内膜增生的影响。方法分离兔骨髓单个核细胞,EBM-2＋SingleQuots培养基培养,鉴定EPC表面标志,并标记。建立兔颈动脉球囊损伤模型,在动脉球囊损伤的即刻,将体外培养的自体EPC经损伤动脉缓慢注入动物体内。分别在手术后7、14天处死动物。检测损伤部位的内皮修复以及内膜增生情况,计算内膜中膜比值（I／M比值）并检测注入的细胞在血管损伤局部的分布。结果EPC治疗组在7、14天的内皮覆盖率分别为（50．923±2．476）％和（82．609±2．611）％,均明显高于对照组,差异有统计学意义。EPC治疗组14天的I／M比值为0．378±0．029,低于对照组,差异有统计学意义。免疫组织化学染色示EPC治疗组损伤血管局部有标记的EPC分布。结论内皮球囊损伤后动脉内注入EPC能有效促进内皮修复,减少内膜增生,预防再狭窄的发生。     

兔外周血内皮祖细胞种植支架的实验研究

目的体外制备兔内皮祖细胞（EPC）种植支架,并评价其可行性。方法采用密度梯度离心法分离兔外周血单个核细胞,接种于人纤维连接蛋白包被的培养板上,予含内皮细胞生长添加剂30μg/mL的M199培养基培养。培养2周后进行免疫荧光染色和免疫细胞化学法鉴定EPC,检测其增殖、迁移、黏附和分泌血管内皮生长因子（VEGF）、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）和一氧化氮（NO）的能力。培养的EPC消化后,将其浇注到有人纤维连接蛋白包被和无包被的裸支架上,6 d后行扫描电镜和荧光显微镜检查,观察其表面细胞的生长情况。结果单个核细胞培养14 d后,出现大量梭形细胞,免疫荧光染色显示细胞可同时摄取Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白和结合FITC标记的凝集素者,表明为正在分化的EPC,同时证实其表达内皮细胞的特异标志vWF。培养2周后的EPC数量呈指数增加;EPC的黏附率为96.7%±3.2%;迁移为15±4细胞/×400视野;可分泌VEGF、G-CSF和NO。与无包被的裸支架组相比,有纤维连接蛋白包被的支架组,EPC黏附多（27.80±4.26细胞/×400视野比6.10±3.07细胞/×400视野,P〈0.05）,内皮化完全。结论EPC可向内皮细胞方向分化,并且具有高增殖、高迁移和高黏附的能力。采用EPC在体外制备细胞种植支架是可行的,而纤维连接蛋白可加速其黏附。