家兔C型利钠肽基因的克隆及鉴定

目的克隆家兔C型利钠肽基因,为其真核表达载体的构建奠定基础。方法通过RT-PCR从家兔腹主动脉组织中克隆C型利钠肽基因全长编码区,将该DNA片段亚克隆至克隆载体pMD18-T中,用Pst Ⅰ单酶切筛选出负向插入片段,对重组质粒进行鉴定。结果PCR、酶切及测序鉴定证实,家兔C型利钠肽基因全长编码区被准确插入到载体pMD18-T的TA克隆位点中。结论成功克隆家兔c型利钠肽基因,为其真核表达载体的构建及开展糖尿病足C型利钠肽基因治疗奠定了基础。     

编码小鼠分泌型Klotho蛋白的cDNA克隆及其重组腺相关病毒载体构建

目的 克隆编码小鼠分泌型Klotho蛋白(secKlotho)的全长cDNA片段,构建secKlotho重组腺相关病毒载体.方法 以小鼠肾脏组织mRNA为模板,通过RT-PCR扩增获得小鼠Klotho基因大片段并克隆至pMD18-T载体中,再采用长臂引物进行二次PCR扩增获得编码secKlotho的全长cDNA片段,经EcoR I/Xho I酶切、连接、转化将目的 片段亚克隆至腺相关病毒载体pAAV-MCS中,酶切及DNA测序对阳性克隆进行鉴定.结果 RT-PCR成功扩增出1 600 bp的小鼠Klotho基因大片段,经二次PCR扩增得到编码secKlotho 的全长1 650 bp cDNA片段,并最终获得3个序列信息和读码框完全正确的pAAV/secKlotho克隆.结论 成功构建小鼠分泌型Klotho重组腺相关病毒载体,为Klotho基因转染治疗慢性肾功能衰竭及冠状动脉粥样硬化等疾病奠定了基础.     

人PPARγ2真核表达载体构建及稳定表达细胞株的建立

目的构建人过氧化物酶体增殖体激活受体γ2（human peroxisome proliferator activa-ted receptorγ2,hPPARγ2）真核表达载体并建立稳定表达hPPARγ2的细胞株。方法用RT-PCR扩增hPPARγ2的全长cDNA并构建出pcDNA3.1（＋）/PPARγ2真核表达载体,经核苷酸序列分析证实。真核表达载体pcDNA3.1（＋）/hPPARγ2转染到HESF细胞,G418筛选,获得稳定表达hPPARγ2的细胞株,检测其在HESF细胞中的表达。结果核苷酸序列测定证实获得hPPARγ2真核表达载体,RT-PCR、间接免疫荧光染色和Western-blot结果显示转染hPPARγ2的细胞株稳定表达hPPARγ2。结论构建了hPPARγ2真核表达载体,并获得稳定表达hPPARγ2的细胞株,为进一步研究hPPARγ2的功能奠定基础。     

人硫氧还蛋白基因分子克隆及真核表达载体的构建

目的克隆人硫氧还蛋白（hTRX）cDNA序列并进行真核表达载体的构建。方法应用RT-PCR技术,以胎肝组织细胞总RNA为模板,扩增出hTRX成熟蛋白的cDNA基因,并克隆至pUCm-T载体中;经PCR和测序鉴定正确后,再构建重组真核表达载体pcDNA3.0-hTRX,采用PCR、双酶切和基因测序鉴定。结果将所得序列与GenBank（J04026）提供的序列比较,其酶活性中心（Trp-Cys-Gly-Pro-Cys）和基序与已知序列一致;PCR、酶切及测序鉴定表明真核表达载体构建正确。结论成功克隆编码hTRX成熟蛋白的cDNA基因,并构建其真核表达载体pcDNA3.0-hTRX。     

幽门螺杆菌NCTC11637、NCTC11639毒素相关基因A的克隆、序列分析及真核表达载体的构建

目的克隆幽门螺杆菌毒素相关基因A(cytotoxin-associated gene A,CagA)全长序列并进行序列分析,构建表达CagA的真核表达载体,研究CagA调控胃泌素基因的表达。方法PCR扩增出CagA基因全长片段后构建克隆载体pMD18-T/CagA7和pMD18-T/CagA9,测序结果登录GenBank,登录号分别为GQ161098(NCTC11637)和GQ161099(NCTC11639),用测序后筛选的PstI和BamHI内切酶将原核载体上的CagA基因酶切后连接到pcDNA3.1/ZEO(-)真核表达载体上,构建真核表达载体pcDNA3.1ZEO(-)/CagA7和pcDNA3.1ZEO(-)/CagA9,并经双酶切和CagA PCR扩增鉴定,最后转染胃癌细胞,检测胃癌细胞中胃泌素基因的表达。结果序列比对结果显示NCTC11637和NCTC11637 CagA的同源性为88.77%,NCTC11637与已收录的NCTC11637(AB015416)同源性为99.22%,序列分析显示两者均有两个Ca-gA酪氨酸磷酸化位点,转染细胞后CagA上调胃泌素基因的表达。结论成功克隆了CagA全长基因,并构建了含CagA全长基因的真核表达载体,在胃癌细胞内上调了胃泌素基因的表达。     

人Peroxiredoxin6基因的克隆与鉴定

目的构建pEGFP—N1-Prdx6真核表达载体,为进一步研究Peroxiredoxin6（Prdx6）在急性肺损伤中的作用奠定基础。方法利用RT—PCR方法扩增人Prdx6基因全长,测序证实后,将其定向亚克隆到真核表达载体pEGFP—N1中,提取质粒作双酶切和测序鉴定。结果人全长Prdx6基因序列正确插入pEGFP-N1载体,测序结果经BLAST分析与GenBank中报道的编码区cDNA序列完全一致。结论通过构建pEGFP-N1-Prdx6真核表达载体可以克隆人Prdx6基因。     

大鼠TIMP-1真核表达载体的构建及其在CHO细胞中的表达

目的 构建大鼠基质金属蛋白酶组织抑制物-1(TIMP-1)的真核表达载体pTIMP-1,并在中国仓鼠卵母(CHO)细胞中表达.方法 从大鼠肝组织提取总RNA,RT-PCR扩增出TIMP-1基因的cDNA片段,将目的 片断克隆至pMD18-T载体,酶切和测序鉴定,然后将目的 片断酶切回收后插入pcDNA3.1,构建真核表达载体pTIMP-1,将该载体转染到CHO细胞后24～48 h,收集细胞上清同时制作细胞爬片,双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)和免疫组化检测TIMP-1的表达情况.结果 扩增出了长约654 bp的基因片段,并将其克隆至pMD18-T载体,酶切和测序鉴定无误;将pMD-TIMP-1中TIMP-1基因亚克隆至pcDNA3.1载体,酶切鉴定无误;pTIMP-1载体转染CHO细胞后,ELISA法可检测到细胞上清中有大量TIMP-1的表达,同时细胞爬片免疫组织化学染色可见胞浆中存在明显的阳性棕染.结论 成功构建了大鼠TIMP-1基因的真核表达载体pTIMP-1,为进一步探讨其功能奠定了实验基础.     

重复水高压注射介导hHGF表达载体在小鼠体内的持续高效表达

目的 构建hHGF表达载体并通过水高压注射法研究hHGF在小鼠体内的持续表达。方法 从慢性乙型肝炎患者肝组织提取总RNA,RT-PCR扩增出hHGF基因的cDNA片段,将目的片断克隆至pMD18-T载体,酶切和测序鉴定,然后将目的片断酶切回收后插入pcDNA3．1质粒,构建真核表达载体pcDNA-hHGF,通过重复水高压注射法将pcDNA-hHGF导入小鼠肝脏,并在首次水高压注射后第0、3、6、9、12、15、18和21天分别收集小鼠血清和肝组织,采用双抗体夹心酶联免疫吸附法检测hHGF在小鼠体内的表达情况。结果 扩增出了长约2187bp的基因片段,并将其克隆至pMD18-T载体,酶切和测序鉴定无误;将pMD-hHGF中hHGF基因亚克隆至pcDNA3．0载体,酶切鉴定无误;首次水高压注射后不同时间检测外周血和肝脏均有hHGF的高水平表达。结论 成功构建了hHGF真核表达载体pCMV-hHGF,重复水高压注射法可将该基因导入小鼠肝脏并获得持续高效的表达。     

人Noggin基因神经细胞特异性表达载体的构建

目的构建具有神经细胞表达特异性的人Noggin基因的真核表达载体，进一步研究Noggin基因在神经系统发育成熟、功能机制方面的作用。方法根据人Noggin基因的cDNA序列，设计合成一对5’端分别含有HindⅢ和XbaⅠ酶切位点的特异性引物，运用RT-PCR方法克隆人Noggin基因的cDNA序列；回收PCR产物，并将其与pMD18 simple T载体连接，进行HindⅢ和XbaⅠ双酶切鉴定和DNA测序鉴定；真核表达载体pCS2 [Tal]-GFP带有神经细胞特异性启动子(alpha1-微管蛋白启动子)，用HindⅢ和XbaⅠ双酶切后琼脂糖凝胶电泳回收带有特异性启动子的片断和T载体上人Noggin基因，在T4DNA连接酶作用下将二者连接，并筛选鉴定。结果RT-PCR产物含有人Noggin基因，DNA测序结果显示重组的pMD18-Noggin载体中含有正确的人Noggin基因序列，重组的pCS2 [Ted]-Noggin载体中含有人Noggin基因的cDNA序列以及alpha1-微管蛋白启动子。结论成功构建了人Noggin基因的神经细胞特异性真核表达载体pCS2 [Ted]-Noggin。     

甲型H1N1流感病毒血凝素HA1蛋白的真核表达与纯化

目的构建甲型SWH1N1流感病毒血凝素HA1蛋白的杆状病毒真核表达载体,转染sf9细胞表达并纯化其编码蛋白。方法从江苏甲型H1N1流感病毒毒株[A/Jiangsu/1/2009（H1N1）]提取病毒RNA,采用RT-PCR技术扩增HA1基因,将其克隆至pMD18-T Simple Vector中构建pMD18-T/HA1质粒,双酶切pMD18-T/HA1与p-fast后,连接构建真核表达载体p-fast-HA1,转化DH10Bac细胞,转座构建杆状病毒HA1-Bacmid,经酶切及测序鉴定后将HA1-Bacmid转染到sf9细胞中,通过免疫印迹法鉴定HA1蛋白的表达,采用亲和层析法纯化HA1蛋白。结果经双酶切、测序鉴定证实HA1基因的真核表达载体构建成功;免疫印迹法证实HA1基因的表达;纯化获得了高纯度的HA1蛋白。结论成功克隆了HA1基因,并构建了其杆状病毒真核表达载体,该表达载体的构建为后期的流感快速检测以及基因工程疫苗制备奠定了良好的基础。     

尿路致病性大肠埃希菌Ⅰ型菌毛fimH基因真核表达载体pcDNA3.0-fimH的构建及鉴定

目的构建尿路致病性大肠埃希菌Ⅰ型菌毛的fimH基因真核表达载体,为尿路致病性大肠埃希菌的核酸疫苗研制奠定基础。方法通过PCR扩增尿路致病性大肠埃希菌临床分离株的fimH全基因序列,克隆至pMD19-T载体,PCR、酶切及测序鉴定后,将fimH基因片段克隆至真核表达载体pcDNA3.0,构建pcDNA3.0-fimH重组质粒,并进行PCR和酶切鉴定。结果 PCR扩增尿路致病性大肠埃希菌fimH基因片段为910 bp;构建的pcDNA3.0-fimH重组质粒经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切,产生1个与fimH基因PCR产物大小一致的小片段和1个不同于pcDNA3.0-fimH重组质粒的大片段,表明fimH基因已成功插入pcDNA3.0质粒中。结论成功构建尿路致病性大肠埃希菌fimH基因真核表达载体pcDNA3.0-fimH。     

细粒棘球蚴内蒙株FABP基因cDNA的克隆与核酸疫苗的构建

【提要】 根据GenBank中细粒棘球蚴脂肪酸结合蛋白(FABP)基因cDNA序列设计引物, 并在起始密码子前加上Kozak 序列(CCACC),提取细粒棘球蚴(内蒙株)的原头蚴总RNA,RT-PCR扩增目的基因。回收其纯化的产物克隆到 pMD19-T载体后进行序列分析。克隆到的FABP基因cDNA序列长402 bp,开放阅读框(ORF)编码133个氨基酸。FABP基因cDNA亚克隆到pcDNA3.1(+)中,构建核酸疫苗pcDNA3.1-FABP-NM, 经测序验证, 结果正确。     

弓形虫pcDNA3-ROP2-p30-HSP70复合基因真核表达重组质粒的构建

目的构建弓形虫pcDNA3-ROP2-p30-HSP70真核表达重组质粒。方法根据HSP70基因序列,设计合成HSP70基因的引物,PCR扩增HSP70基因片段,克隆入pMD18-T载体,再经酶切、连接等,亚克隆至pcDNA3-ROP2-p30表达重组质粒中,并进行酶切、PCR和测序鉴定。结果 PCR扩增出长度为916bp的HSP70基因片段,将其克隆到pMD18-T中,成功亚克隆获得pcDNA3-ROP2-p30-HSP70表达重组质粒。测序结果显示,pcDNA3-ROP2-p30-HSP70表达重组质粒包含了HSP70蛋白基因完整序列。结论成功构建弓形虫pcDNA3-ROP2-p30-HSP70真核表达重组质粒,为下一步核酸疫苗的研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌ESAT-6蛋白的表达与纯化

目的构建结核分枝杆菌esat-6基因原核表达载体,使其在大肠杆菌中表达融合重组蛋白,并纯化。方法用PCR方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出esat-6基因片段,克隆至pMD18-T载体,PCR筛选阳性克隆并测序;用限制性内切酶消化后,目的片段亚克隆至表达载体pGEX-4T-2,构建pGEX-esat-6重组质粒,将其转化入大肠杆菌JM109;PCR和双酶切鉴定转化菌落;将阳性菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE和免疫印迹分析靶蛋白的表达;用谷胱甘肽-琼脂糖亲合层析法纯化融合蛋白。结果PCR扩增出esat-6 288bp的基因,克隆到pMD18-T载体中,经测序与GenBank中序列一致;随后亚克隆到表达载体pGEX-4T-2构建重组表达质粒,在JM109中表达了ESAT-6融合蛋白,表达的蛋白能被GST免疫血清识别;通过亲和层析纯化获得的蛋白能被结核病人血清识别。结论成功构建esat-6重组表达质粒,该质粒在JM109中表达ESAT-6融合蛋白,并获得较纯的蛋白。     

周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶基因原核和真核表达质粒的构建

目的构建我国流行的周期型马来丝虫半胱氨酸蛋白酶（BmCP）基因原核和真核表达质粒，为进一步研究奠定基础。方法从周期型马来丝虫虫体中提取总RNA，反转录成cDNA，设计合成引物，以eDNA为模板，通过PCR从eDNA中扩增出目的基因，扩增产物经初步鉴定后将其克隆入pMD18-T载体，进行双酶切及PCR扩增鉴定，获得阳性重组质粒，进行测序分析和同源性比较。阳性克隆的质粒亚克隆至真核表达质粒peDNA3．1（＋），转化感受态大肠埃希菌（E-coli）DH5α，筛选阳性克隆，用PCR和双酶切鉴定阳性重组子。结果RT—PCR扩增出1条约1201bp的特异性条带，重组质粒双酶切和以质粒为模板的PCR结果与预期相符．DNA序列分析与GenBank已知的基因序列同源性为99％。构建了真核重组表达质粒peDNA3．1-BmCP。结论成功构建了周期型BmCP原核和真核重组表达质粒，为进一步研究该基因的功能提供了条件。     

粉尘螨Ⅰ类变应原的cDNA克隆测序及亚克隆

目的　获得粉尘螨I类变应原(Derf1)cDNA克隆及亚克隆,并进行测序。　方法　设计合成引物,从粉尘螨体内提取RNA,经逆转录聚合酶链反应(RTPCR)获得cDNA,PCR扩增目的片段经纯化回收后克隆至pMD18T,转化大肠埃希菌(E.coli)JM109,经PCR初筛挑选阳性克隆并测序,将PCR筛检阳性重组子及pET32a(+)表达载体分别用BamHⅠ和SacⅠ双酶切,连接转化至E.coli感受态细胞JM10 9中过夜培养,挑选菌落进行酶切鉴定。　结果　从粉尘螨基因组RNA中扩增出Derf1基因,获得pET32a(+)Derf1亚克隆,酶切产物的大小与预期相符。　结论　对粉尘螨Derf1基因进行体外扩增并获得pET32a(+)Derf1亚克隆。     

AQP5基因重组慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建人水通道蛋白5（AQP5）基因慢病毒载体。方法体外扩增出AQP5基因全长cDNA,将慢病毒载体pWPTS-GFP与扩增出的AQP5用MluⅠ和SalⅠ进行双酶切,将AQP5全长序列克隆入pWPTS-GFP,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,对长出的克隆用菌落PCR鉴定,再对阳性克隆进行测序和比对分析。重组病毒质粒与另外两种辅助包装原件载体质粒通过CaCl2共转染293T细胞（人胚肾细胞）,培养48 h后收集细胞培养上清液,将病毒浓缩后在293T细胞中测定病毒滴度,并检测慢病毒载体在工具细胞SGC7901细胞（胃癌细胞）的转染效率。Western blot检测SGC7901细胞中AQP5蛋白。结果测序结果和Western blot检测均证明AQP5重组慢病毒载体构建正确,并能在细胞中正确表达。与辅助质粒共转包装细胞获得慢病毒颗粒,并成功感染SGC7901细胞。包装慢病毒,浓缩病毒悬液的滴度为1×108 TU/ml。结论成功构建了稳定表达AQP5基因的重组慢病毒载体。     

日本血吸虫磷酸甘油酸激酶基因T／A克隆及序列分析

目的获取日本血吸虫磷酸甘油酸激酶(SjPGK)编码基因片段，分析其核苷酸序列，为日本血吸虫病疫苗研制提供候选抗原分子。方法根据曼氏血吸虫磷酸甘油酸激酶(SmPGK)cDNA序列设计1对引物，采用逆转录一聚合酶链反应(RT—PCR)方法，从日本血吸虫成虫总RNA中扩增SjPGK基因片段。利用T／A克隆法，将其克隆人pMD18-T载体，经双酶切分析和PCR鉴定，将阳性克隆进行脱氧核糖核酸序列测定；运用Blast程序，将测序结果及其推导的编码氨基酸序列与NCBI数据库在核苷酸水平和氨基酸水平进行同源性比较。结果RT—PCR特异性扩增出1条长约830bp大小的条带；经酶切和PCR鉴定表明所构建的质粒pMD18-T—SjPGK中含有所扩增的基因序列；脱氧核糖核酸序列测定和分析，SjPGK基因片段长为830bp，与SmPGK的核苷酸同源性为85％，分值为672；氨基酸同源性为94％，分值为473。结论成功克隆SjPGK编码基因片段，为进一步实验提供了条件。     

人胆固醇酯水解酶真核表达载体的构建及U937细胞系的转染

目的构建人胆固醇酯水解酶（hCEH）绿色荧光蛋白真核表达载体pEGFP-N1-hCEH,并观察其转染单核巨噬细胞株U937后,细胞中hCEH的表达情况。方法以人肝细胞L-O2总RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增hCEH编码区序列,将扩增片段插入到pMD19-T载体中,回收、纯化目的片段后亚克隆到pEGFP-N1真核表达载体上,经双酶切、测序鉴定后,转染U937,观察U937中绿色荧光蛋白的表达情况。结果 RT-PCR扩增hCEH基因的编码区序列获得1条约1.7 kb的片段,与预期片段大小相符;以pEGFP-N1为载体,成功构建重组表达质粒pEGFP-N1-hCEH,该质粒可以在U937中表达。结论成功构建pEGFP-N1-hCEH,用其转染U937后,细胞中pEGFP-N1-hCEH大量表达。     

幽门螺杆菌GGT基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的: 克隆幽门螺杆菌( H pylori)γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyl transpeptidase,GGT)基因,实现GGT基因在大肠杆菌中的表达.方法: 从胃癌患者胃黏膜组织中分离培养获得H pylori,提取其基因组DNA,对GGT基因进行PCR扩增,克隆进pMD18-T载体,酶切和测序验证,构建原核表达载体pET-28a(+)-GGT,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达重组融合蛋白,SDS-PAGE及Western blot分析检测表达产物.结果: 成功克隆了GGT基因,经酶切和测序验证正确,成功构建了pET-28a(+)-GGT质粒,高效表达出了68 kDa的融合蛋白.结论: 在大肠杆菌中成功表达了GGT重组融合蛋白,为进一步研究GGT与线粒体介导的细胞凋亡之间的关系奠定了基础.