三氧化二砷联合8-CPT-cAMP诱导维甲酸耐药早幼粒细胞白血病细胞分化的实验研究

目的 了解三氧化二砷（As2O3)联合8-对氯苯硫基环腺苷酸（8-CPT-cAMP)对维甲酸（RA）耐药、的急性早幼粒细胞白血病（APL）细胞的作用。方法 以RA耐药的APL细胞株NB4-R1和NB4-R2为模型。通过观察细胞生长，形态，表面分化抗原以及对四氮唑蓝的还原能力的改变来研究As2O3,8-CPT-cAMP单独和联合对细胞增殖及分化的影响；并应用免疫荧光和Western blot检测药物处理前后细胞内PML-RARα融合蛋白以及细胞周期调控蛋白的变化。结果 低剂量As2O3(0.25μmol/L）与8-CPT-cAMP(200μmol/L）可协同促进NB4-R1和NB4-R2细胞分化。8-CPT-cAMP可通过影响细胞周期调控蛋白E2F和P21的表达而抑制细胞增殖，并促进As2O3介导的PML-RARα融合蛋白降解。结论 As2O3联合8-CPT-cAMP能够诱导RA耐药的APL细胞分化。     

苦参碱对急性早幼粒细胞白血病细胞维甲酸耐药的逆转作用研究

目的 探讨苦参碱逆转急性早幼粒细胞白血病(APL)全反式维甲酸(ATRA)耐药的作用及可能的机制.方法 以ATRA敏感的APL细胞系NB4及其ATRA耐药株NB4-R1、NIM-R2作为研究对象.用MTT法明确苦参碱低毒性剂量,进一步计算ATRA联合100μmoL/L苦参碱作用前后细胞ATRA IC50值,明确苦参碱的逆转耐药倍数;用NBT还原实验分析不同浓度(10、8、6、4、2、1、mmol/L,100、10、1μmol/L)苦参碱联用1μmol/L ATRA对耐药细胞分化能力的影响,并观察细胞形态变化;Annexin V/PI染色流式细胞术检测不同浓度苦参碱联用1 μmol/L ATRA作用下细胞凋亡率.结果 ①苦参碱对NB4、NB4-R1、NB4-R2细胞的增殖抑制作用随浓度增加而增强,IC50值分别为(0.661±0.035)、(0.673±0.132)、(0.329±0.020)mmol/L;②联用100 μmol/L苦参碱能显著逆转NB4-R1细胞的耐药性(逆转耐药倍数为4.96±1.15),但不能增强NB4-R2细胞对ATRA的敏感性,甚至增强其耐药性(逆转耐药倍数为0.66±0.17);③苦参碱与1 μmol/L ATRA联用时,NB4、NB4-R1细胞的分化能力随苦参碱作用浓度的增大而增强,且在苦参碱为100 μmol/L时达到峰值(P<0.05),但对NB4-R2细胞无明显影响;④1 μmol/L ATRA联合苦参碱能显著提高NB4、NB4-R1细胞凋亡率(P<0.05和P<0.01),但对NB4-R2细胞同样无明显作用.结论 苦参碱能有效逆转NB4-R1细胞的ATRA耐药,可能与其协同ATRA诱导分化及促进细胞凋亡有关.苦参碱与ATRA联用非但不能缓解NB4-R2细胞的ATRA耐药,甚至可能加重耐药、阻断耐药细胞的凋亡过程.     

环磷腺苷和其衍生物8-CPT-cAMP诱导分化效应的比较实验

目的:比较环磷腺苷和其衍生物8-CPT-cAMP在联合全反式维甲酸(ATRA)诱导耐药型早幼粒白血病细胞株NB4-R1分化中的作用。方法:将环磷腺苷和8-CPT-cAMP分别与ATRA联合处理NB4-R1细胞株,在不同时间点收集细胞,观察细胞形态、硝基四氮唑蓝(NBT)的还原能力,以及细胞表面分化抗原CD11b的表达情况。结果:单独使用环磷腺苷或8-CPT-cAMP均无法诱导NB4-R1细胞分化;但8-CPT-cAMP可以恢复NB4-R1细胞对ATRA的反应性,8-CPT-cAMP与ATRA合用可以使NB4-R1细胞表面分化抗原CD11b的阳性率达到(86.5±7.78)%,与对照组和ATRA单用组相比均有显著性差异;同时,细胞对NBT的还原能力也明显升高,比对照组或ATRA单用组提高了5倍左右。而环磷腺苷与ATRA联合处理只能诱导NB4-R1细胞出现部分分化的特征,CD11b的阳性率可上升至(50.7±3.11)%,但细胞对NBT的还原能力却没有明显提高。结论:环磷腺苷对维甲酸耐药型细胞株NB4-R1细胞的分化具有一定的促进作用,但是效果明显不如其衍生物8-CPT-cAMP。     

姜黄素联合全反式维甲酸诱导耐药的急性早幼粒细胞白血病细胞分化的实验研究

本研究旨在探讨姜黄素联合全反式维甲酸(ATRA)对耐药的急性早幼粒细胞白血病细胞分化的影响及其分子机制。以耐药的NB4-R1细胞为实验对象,对细胞进行计数和细胞形态学观察,应用流式细胞术(FCM)检测姜黄素单用或联合ATRA对NB4-R1细胞增殖、分化的影响;用Western blot检测AKT磷酸化在细胞分化中的变化。结果显示,全反式维甲酸对NB4-R1细胞增殖无影响,但可增强姜黄素对NB4-R1生长的抑制作用。单用姜黄素或全反式维甲酸对细胞分化无影响,姜黄素联合全反式维甲酸可明显诱导细胞CD11b表达,细胞在形态上呈明显分化特征。全反式维甲酸可在短时间内促进NB4细胞AKT第473苏氨酸磷酸化,而对NB4-R1细胞中的AKT磷酸化影响不大。姜黄素可以促进NB4-R1细胞AKT磷酸化,而联合全反式维甲酸可进一步增强AKT磷酸化。结论:PI3K/AKT通路失活可能是导致APL细胞耐药的因素之一,而姜黄素通过活化PI3K/AKT信号通路逆转APL耐药,促进NB4-R1细胞分化。     

原肌球蛋白、丙酮酸激酶在急性早幼粒细胞白血病耐药细胞中表达上调

目的应用蛋白质组学方法筛选人急性早幼粒细胞白血病（APL）维甲酸敏感细胞株（NB4细胞株）和维甲酸耐药细胞株（NB4-R1细胞株）的耐药相关蛋白。方法利用双向凝胶电泳技术检测，比较NB4和NB4-R1细胞株的总蛋白，建立二维凝胶电泳（two-dimensional gel ectmphoresis，2-DE）图谱。从多个差异蛋白质点中选择出2个在NB4-R1细胞株中表达明显上调的蛋白质点进行MALDI-TOF-MS生物质谱分析，并用Mascot软件在SwissProt和NCBInr数据库中进行同源比较和分析鉴定。结果确定表达明显上调的两个蛋白质分别为原肌球蛋白（tmpomyosin，TM）和丙酮酸激酶（Pymvate kinase，PK）。结论本研究表明维甲酸耐药细胞中原肌球蛋白和丙酮酸激酶表达上调，提示它们在肿瘤耐药中有重要作用。     

地西他滨对全反式维甲酸耐药细胞株NB4-R2的增殖抑制及诱导凋亡作用研究

本研究探讨地西他滨(DAC)对全反式维甲酸耐药细胞株NB4-R2的增殖抑制及诱导凋亡作用。应用细胞增殖及毒性检测法(新型四唑单钠盐法)观察0.01-0.5μmol/L DAC作用于NB4-R2细胞24、48及72 h后的细胞增殖活力变化;PI单染及AnnexinⅤ-FITC/PI双染流式细胞术观察不同浓度DAC(0.05-5μmol/L)对NB4-R2处理48 h后的细胞凋亡率;RT-PCR法检测编码P糖蛋白(P-gp)的多药耐药基因1(MDR1)转录水平的变化。结果表明,0.01-0.5μmol/L DAC可抑制NB4-R2细胞增殖,并呈现明显的量-效与时-效关系;作用48及72 h后的IC50分别为0.089和0.064μmol/L;0.05-5μmol/L DAC以浓度依赖的方式诱导NB4-R2细胞凋亡,下调MDR1基因表达。结论:低浓度DAC(<0.5μmol/L)对NB4-R2细胞有增殖抑制作用,较高浓度DAC(1、5μmol/L)可以诱导NB4-R2细胞凋亡,同时使MDR1表达下调。     

丹参酮ⅡA对NB4细胞PML-RARαmRNA和融合蛋白的影响

我们采用急性早幼粒细胞白血病(APL)NB4细胞株作为体外细胞模型，检测丹参酮ⅡA(TanⅡA)作用NB4细胞后早幼粒细胞白血病-维甲酸受体α(PML-RARα）mRNA和融合蛋白的变化，探索TanⅡA诱导NB4细胞分化与凋亡的分子机制。     

姜黄素诱导维甲酸耐药的NB4-R1细胞凋亡及其机制

为了探讨姜黄素对维甲酸耐药的急性早幼粒细胞白血病细胞生长抑制作用及其机制,以耐药的NB4-R1细胞为实验对象,用MTT法检测细胞生长情况,用光学显微镜观察细胞形态特征,用流式细胞术测定细胞线粒体电位变化,用Western blot检测细胞凋亡相关蛋白的表达水平。结果表明,虽然NB4-R1细胞对维甲酸耐药,但对姜黄素的敏感性与对维甲酸敏感的NB4细胞一致,姜黄素至少对NB4-R1细胞的生长抑制作用呈时间和剂量依赖性。细胞形态学检查显示,经20μg/L姜黄素处理后的细胞内出现凋亡小体。流式细胞术检测发现,NB4-R1细胞经姜黄素处理后线粒体膜电位下降。Western blot检测显示,caspase3前体表达下降,活化caspase3表达升高,BCL-XL表达降低,剪切形式的PARP表达水平明显上调。结论:姜黄素能抑制NB4-R1细胞生长并诱导其凋亡。     

全反式维甲酸诱导APL细胞分化过程中钙信号途径基因表达水平的变化

为研究钙信号途径在髓系分化中的作用,采用基因芯片技术检测了钙信号途径相关基因在全反式维甲酸(ATRA)诱导急性早幼粒细胞性白血病(APL)细胞株NB4细胞分化过程中的表达情况,并运用实时定量RT-PCR验证基因芯片部分结果,同时检测这些基因在ATRA和8-CPT-cAMP单独和联合作用于NB4-R1细胞和ATRA诱导APL初诊患者原代细胞分化时的表达情况。结果发现:在ATRA诱导NB4细胞分化过程中,许多能直接调节胞内钙离子浓度的基因发生了变化,同时发现许多钙信号途径下游的效应分子的表达上调,并得到实时定量RT-PCR验证。这些基因在ATRA和8-CPT-cAMP单独作用于NB4-R1细胞时变化不大,而在ATRA和8-CPT-cAMP联合作用于NB4-R1细胞分化时与ATRA诱导NB4细胞分化时的表达变化相似。另外,以上基因在ATRA诱导APL初诊患者原代细胞分化的变化情况与诱导NB4细胞分化时相似。结论:钙信号途径可能参与了ATRA诱导的APL细胞分化。     

Staurosporine诱导维A酸耐药早幼粒细胞白血病细胞株分化的研究

目的:研究蛋白激酶C抑制剂staurosporine对全反式维A酸(ATRA)耐药的急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞株的诱导分化作用及其可能的机制。方法:以ATRA耐药的APL细胞株NB4-R1为模型,通过检测细胞表面分化抗原CD11b,并进行四唑氮蓝(NBT)还原实验和形态学观察,分析Staurosporine对NB4-R1细胞分化的影响;应用蛋白印迹法检测staurosporine对C/EBPβ、C/EBPε和PML-RARα蛋白表达水平的影响。结果:与对照组相比,staurosporine处理72 h后,细胞CD11b阳性率从(5.84±1.89)%上升到(65.90±2.00)%,差异有统计学意义(P     

新型含氮双氢青蒿素二聚体对人白血病细胞株NB4-R1细胞凋亡的影响

目的：探讨新型水溶性含氮双氢青蒿素二聚体SM 1044对全反式维甲酸耐药急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4-R1细胞凋亡的影响及其可能的机制。方法：流式细胞术检测SM 1044对细胞凋亡、线粒体跨膜电位以及细胞活性氧(ROS)水平的影响，Western blot检测SM 1044对MAPK(ERK、JNK)信号通路以及PML/RARα融合蛋白的影响和凋亡相关蛋白表达的变化。结果：SM 1044能够显著诱导NB4-R1细胞发生细胞凋亡以及线粒体跨膜电位丢失，同时能活化凋亡相关蛋白caspase-3、caspase-8、caspase-9以及抗多腺苷二磷酸核糖聚合酶；SM 1044可诱导NB4-R1细胞产生ROS;Western blot检测结果显示，SM 1044能够激活MAPK(ERK、JNK)信号通路的磷酸化，同时下调PML/RARα融合蛋白的表达。结论：SM 1044能够诱导全反式维甲酸耐药急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4-R1细胞凋亡，其诱导凋亡可能与ROS/ERK以及ROS/JNK信号通路有关，此外，SM 1044也可通过下调PML/RARα融合蛋白诱导细胞凋亡。     

丹参酮ⅡA对初治、复发及耐药人急性早幼粒细胞白血病细胞体外诱导分化作用

丹参酮ⅡA（TanⅡA）是从活血化瘀中药丹参中提取的有效成分。体外研究表明，TanⅡA对多种肿瘤细胞具有细胞毒作用及诱导分化作用。近来有学者发现，0．5μg／ml TanⅡA在体外能诱导急性早幼粒细胞白血病（APL）细胞株NB4细胞及维甲酸耐药APL细胞株MR-2细胞分化成熟。在此基础上，我们选择11例临床初治、复发及全反式维甲酸（ATRA）耐药的APL患者白血病细胞进行原代培养，进一步证实TanⅡA对APL细胞体外诱导分化作用，为其临床运用提供更加可靠的实验室依据。     

α干扰素联合全反式维甲酸对急性早幼粒细胞白血病细胞系NB4、NB4-R1增殖和分化的影响北大核心CSCD

急性早幼粒细胞白血病（APL）是临床常见的一种急性白血病,全反式维甲酸（ATRA）是诱导APL缓解的主要药物,90％的APL患者通过ATRA治疗可获得完全缓解,但APL复发和ATRA耐药仍是困扰临床医师的主要难题,也是目前APL治疗方面研究的热点之一.有研究发现APL患者ATRA耐药与缺乏干扰素合成的一些蛋白质有关,我们通过探讨IFN-α联合ATRA对APL细胞系NB4及ATRA耐药APL细胞系NB4-R1增殖和分化的影响,为治疗ATRA耐药的APL提供理论依据.     

环氧化酶2抑制剂塞来昔布诱导 NB4细胞凋亡的研究

目的：研究环氧化酶2（COX-2）选择性抑制剂塞来昔布对髓性白血病细胞株 NB4凋亡的影响,探讨塞来昔布诱导细胞凋亡的机制。方法RT-PCR 检测不同细胞系中 COX-2 mRNA 表达,MTT 法检测 NB4细胞增殖抑制,DNA Ladder 试验分析NB4细胞 DNA 片段化,流式细胞术检测 NB4细胞 Bcl-2蛋白的表达。结果与未加药处理组相比,不同浓度塞来昔布作用后DNA Ladder 片段随浓度的增加而更为明显。不同用药组25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L 塞来昔布组 Bcl-2蛋白表达率分别为（71．69±1．65）％、（34．51±2．53）％和（29．28±2．38）％,与空白对照组 Bcl-2蛋白表达率为85．34±2．89％相比,50μmol/L、100μmol/L 塞来昔布组 Bcl-2蛋白明显下降（P ＜0．05）。结论COX-2选择性抑制剂塞来昔布通过下调 NB4细胞 Bcl-2蛋白表达致诱导其凋亡。     

腺苷酸环化酶的活化影响NB4细胞对全反式维甲酸的敏感性

目的　探讨急性早幼粒细胞白血病 (APL)细胞对全反式维甲酸 (ATRA)耐药的分子机制。方法　以ATRA敏感及耐药的APL细胞株NB4和NB4 R1为模型 ,观察细胞形态、表面分化抗原以及对四氮唑蓝还原能力的改变 ,分别研究腺苷酸环化酶 (AC)和磷酸二酯酶 (PDE)的特异激活剂毛喉素、拮抗剂 9 (四氢 2 呋喃基 ) 9H 嘌呤 6 氨 (SQ2 2 5 36 )对ATRA诱导分化作用的影响。结果　AC的拮抗剂SQ2 2 5 36能显著抑制ATRA对NB4细胞的诱导分化作用 ,ATRA SQ2 2 5 36组与ATRA组比较 ,CD11b阳性率由 (95 .9± 2 .5 ) %降至 (6 0 .3± 7.1) % ,NBT还原实验吸光度 (A) 540 值由 0 .5 85±0 .0 92降至 0 .170± 0 .0 2 8,差异有显著性 (P <0 .0 5 )。而AC的激活剂毛喉素则可以克服NB4 R1细胞对ATRA的耐药 ,ATRA 毛喉素组与ATRA组比较 ,CD11b阳性率由 (34.3± 5 .3) %升高至 (94 .6±2 .4 ) % ,NBT还原实验A540 值由 0 .110± 0 .0 2 8升高至 0 .395± 0 .0 4 9,差异有显著性 (P <0 .0 5 )。PDE的特异激活剂钙调蛋白以及拮抗剂 3 异丁基 1 甲基黄嘌呤 (IBMX)对ATRA的作用基本没有影响。结论　AC能否正常激活也许是APL对ATRA产生耐药的重要原因之一。     

小剂量亚硒酸钠和全反式维甲酸联合使用诱导NB4细胞的凋亡及分化

目的 研究小剂量亚硒酸钠（2－5μmol/L）与全反式维甲酸（ATRA）联合使用对人急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4凋亡及分化的影响。方法 采用膜联蛋白V（Annexin-V)荧光标记试剂盒检测细胞的磷脂酰丝氨酸（PS）外翻率和DNA片段化的琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡，通过流式细胞术检测粒系分化细胞表面特异抗原CD11b表达，NBT还原实验检测细胞分化。结果 阴性对照组细胞术检测粒系分化细胞表达特异抗原CD11b表达，NBT还原实验检测细胞分化。结果 阴性对照组细胞PS外翻率为1．2％，5μmol/L亚硒酸钠处理NB4细胞48h后PS外翻率为0.8%,0.1μmol/L ATRA诱导48h后PS外翻率为2．0％，与对照组相比，差异均无显著性,而两者联合作用NB4细胞24，36，48h后的PS外翻率分别达到18.3%,25.9%,50.0%,DNA电泳呈典型的梯形带。小剂量（2μmol/L）亚硒酸钠没有诱导NB4细胞分化的能力，但其与0．1μmol/L的ATRA联合使用同单独使用0．1μmol/L的ATRA钠没有诱导NB4细胞分化的能力，但其与0．1μmol/L的ATRA联合使用单独使用0．1μmol/L的ARTA相比，CD11b表达阳性细胞率进一步增加，NBT还原能力也进一步增强。结论 小剂量的亚硒酸钠与ATRA联合使用可诱导NB4细胞发生凋亡及分化。     

全反式维甲酸诱导急性早幼粒细胞白血病细胞分化中分化抑制因子1表达水平的变化

目的 探讨分化抑制因子1(ID1)在全反式维甲酸(ATRA)诱导急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞分化中的作用.方法 运用基因芯片、放线菌酮抑制试验、实时定量RT-PCR和Western blot.方法 检测ID1存ATRA诱导的APL细胞系及原代APL细胞分化过程中表达情况.结果 在ATRA污导的NB4细胞和APL初诊患者原代细胞分化过程巾ID1基因的表达上调,ATRA诱导NB4细胞2hID1表达达高峰,其相对表达水平与对照相比升高359.4±48.7倍;ATRA处理APL患者骨髓细胞ID1表达水平2 h达高峰,其中1例患者晕复3次检测的.结果 为对照的(311.1±48.7)倍.而且ID1基因的上调不需要其他蛋白的合成.而在ATRA处理ATRA耐药细胞系NB4-R2细胞未见ID1的表达发生明显变化.结论 ID1基因可能作为ATRA的靶基因参与了ATRA诱导的粒系分化.     

NB4细胞株分化中NDRG1表达的研究

目的:应用多种分化诱导剂处理急性早幼粒细胞白血病(APL)细胞系NB4细胞株,探讨NDRG1表达在白血病细胞诱导分化中的作用.方法:采用1×10-7mol/L全反式维甲酸(ATRA)、1%二甲基亚砜(DMSO)和20nmol/L佛波酯(TPA)分别处理NB4细胞48h,并通过细胞染色、流式细胞检测、蛋白印迹(Western blot)和实时PCR分别检测分化细胞的核型、CDllb、CDllc、CDl4表达,观察ndrgl mRNA与蛋白的变化.结果:3种分化诱导剂分别处理细胞株后,细胞核缩小且呈分叶状改变,细胞内NDRG1蛋白表达均呈时间依赖性上调;经ATRA和DMSO处理的细胞,其ndrgl mRNA发生上调,而经TPA处理的细胞却未发生ndrgl mRNA表达上调.结论:细胞信号调控分子NDRG1与细胞分化密切相关.     

尿多酸肽联合亚砷酸对K562细胞凋亡及细胞增殖的影响

【目的】观察尿多酸肽（cDA-2）、亚砷酸、CDA_2与亚砷酸联合体外诱导慢性髓细胞白血病细胞（K562）株凋亡、抑制增殖的作用;探讨CDA-2与亚砷酸联合对诱导K562细胞凋亡及抑制增殖的协同作用。【方法】不同浓度的CDA-2、亚砷酸及二者联合处理K562细胞株,通过MTT比色法检测K562细胞细胞生长率,计算IC50值;应用倒置相差显微镜、A0荧光染色观察细胞凋亡及形态学变化;应用流式细胞术检测细胞凋亡。【结果】①MTT结果显示,在一定的范围内,K562细胞的生长率存在剂量及时间依赖性降低,CDA-2作用K562细胞24h、48h、72h的IC50值分别为75mg／L、59mg／L和37mg／L,亚砷酸作用K562细胞24h、48h、72h的IC50值分别为11．55μmol／L、6．14gmol／L及5．18μmol／L;②荧光染色结果显示,与未加药的对照组相比,二者单药均可促进细胞凋亡,二者联合后凋亡作用更加显著;③流式细胞术显示,cDA-262．5mg／L处理K562细胞24h早期凋亡细胞为（1．77±0．49）％,亚砷酸4umol／L处理K562细胞24h早期凋亡细胞为（1．33±0．58）％,而相同浓度的二者联合用药作用于K562细胞24h早期凋亡细胞为（11．03±0．7）％（P〈0．05）,按照预计效应公式得出,两药联合存在协同作用,且协同作用于24h,两药最低浓度联合时已开始,随着两药浓度的增加,协同作用逐渐增大。【结论】CDA-2、亚砷酸单药及二者联合均可抑制K562细胞株增殖并促进凋亡,二者具有协同作用。