小鼠β-防御素2肿瘤疫苗的抗白血病作用研究

目的：探讨小鼠β-防御素2（MBD2）肿瘤疫苗的体内抗白血病作用及其机制。方法：小鼠体内接种转染MBD2的L1210小鼠白血病细胞（L1210-MBD2），观察细胞的致瘤性改变；对长期存活的小鼠用野生型L1210细胞进行二次攻击，探讨瘤苗的免疫保护作用；用照射L1210-MBD2瘤苗注射荷瘤小鼠，检测瘤苗的治疗效果。采用乳酸脱氢酶活性法测定接种瘤苗后小鼠脾脏细胞CTL及NK细胞毒活性，ELISA法检测脾细胞产生IFN-γ及IL-12含量。结果：转染MBD2使L1210细胞致瘤性明显降低（P〈0．05），80％小鼠长期生存；对照组小鼠全部死亡。用野生型L1210细胞二次攻击后100％dx鼠仍能长期生存。照射瘤苗能使50％的荷瘤小鼠长期生存，而对照组小鼠则全部死亡，两者之间具有显著性差异（P〈0．05）。接种MBD2瘤苗后，小鼠脾细胞对L1210的CTL及NK杀伤活性明显增强（P〈0．05），产生IFN-γ、IL-12水平显著升高（P〈0．05）。结论：L1210-MBD2瘤苗通过调节机体细胞免疫反应显示出较强的体内抗白血病作用，为淋巴细胞性白血病的免疫治疗提供了新策略。     

mIL-21基因转染的Sp2/0瘤苗细胞的抗肿瘤机制探讨

目的:探讨小鼠IL-21瘤苗-Sp2/0-mIL-21抗肿瘤效应的机制。方法:用流式细胞术检测Sp2/0-mIL-2瘤苗细胞表面MHC-Ⅰ类分子及CD80分子的表达。以瘤苗细胞接种BALB/c小鼠,以CFSE,7-AAD标记,用流式细胞术检测NK细胞、CTL的细胞毒活性。观察肿瘤组织中淋巴细胞的浸润。用RT-PCR检测肿瘤组织中CXC家族趋化因子I-TAC的表达。结果:与对照组相比,瘤苗细胞膜表面MHC-Ⅰ类分子的表达明显上调。瘤苗接种组小鼠NK细胞、CTL的细胞毒活性明显增强。病理分析发现,肿瘤组织中有较多的淋巴细胞浸润并检测到干扰素诱导的T细胞α趋化因子(I-TAC)的表达上调。结论:肿瘤细胞瘤苗Sp2/0-mIL21可增强小鼠的细胞免疫作用,其抗肿瘤机制可能与T细胞的增殖、活化,促进NK细胞的分化成熟,淋巴细胞向肿瘤组织浸润,以及增强NK细胞和CTL的细胞毒活性有关。     

小鼠白介素18与白介素1β转化酶共表达载体的构建及真核表达

为了制备白介素18前体(proIL-18)和白介素1β转化酶(ICE)共表达肿瘤疫苗,从小鼠脾细胞克隆proIL-18和ICE基因,构建小鼠proIL-18和ICE共表达质粒(pIRES-proIL-18-ICE),经测序证实序列正确后,脂质体法转染小鼠淋巴细胞白血病细胞系L1210,筛选稳定表达细胞株。转染细胞RT-PCR及转染细胞培养上清IL-18ELISA检测结果表明,肿瘤细胞可以表达并分泌成熟的IL-18。培养上清的IL-18可显著诱导ConA刺激的小鼠脾细胞产生IFN-γ,表明其具有功能活性。生长曲线和细胞周期实验证实与未转染的肿瘤细胞相比,转染空载体pIRES、pIRES-proIL-18、pIRES-ICE、pIRES-proIL-18-ICE基因对肿瘤细胞生长增殖无明显影响。IL-18白血病瘤苗的成功制备表明,利用pIRES载体在同一肿瘤细胞中共表达的proIL-18和ICE能够完全模拟生理过程,在真核细胞内有效酶切,分泌出成熟并有功能活性的IL-18;构建的IL-18瘤苗为进一步评价其在小鼠体内的抗白血病效果奠定基础。     

IL—6基因转染的瘤苗体内诱导的抗肿瘤免疫功能与效果

经丝裂霉素C体外处理后,将IL-6基因转染的、高分泌的IL-6的B16黑色素瘤细胞制成瘤苗。结果发现,体内注射IL-6基因转染的瘤苗后,小鼠脾脏CTL活性、NK活性及IL-2诱导的LAK活性显著升高。经IL-6基因转染瘤苗体内治疗后,荷瘤小鼠的皮下肿瘤生长显著减慢、肺转移结节数显著降低、存活期显著延长,若同时合用低剂量IL-2,则上述治疗效果更好。可见IL-6基因转染的瘤苗能有效地通过诱导机体抗肿瘤免疫功能而发挥抗肿瘤作用,与低剂量IL-2合用后,IL-6基因转染的瘤苗的抗肿瘤效果更佳。     

表达CRT-E2融合蛋白肿瘤疫苗诱导特异性抗肿瘤免疫应答

目的:探讨表达钙网蛋白(Calreticulin,CRT)和HPV E2融合蛋白的肿瘤疫苗在小鼠体内诱导的抗肿瘤免疫应答.方法:转染重组质粒得到高表达CRT、E2和CRT-E2融合蛋白的肿瘤细胞,作为肿瘤疫苗隔周两次腹腔注射免疫小鼠,17天后观察成瘤率,检测NK细胞杀伤活性、特异性T细胞增殖能力、CIL活性以及睥淋巴细胞分泌IFN-γ水平,并观察荷瘤小鼠生存期.结果:高表达CRT-E2融合蛋白肿瘤疫苗免疫小鼠后,其成瘤率明显低于其他实验组,NK细胞杀伤活性、特异性T细胞增殖能力、CTL活性和脾淋巴细胞分泌IFN-γ水平均显著高于其它实验组(P＜0.01),生存期也明显延长(P＜0.01).结论:小鼠体内实验显示,表达CRT-E2融合蛋白肿瘤疫苗能够诱导特异性CD8+T细胞免疫应答和NK细胞活性,显著抑制了肿瘤生长.     

IFN-γ对体外培养系统中IL-18诱导的肿瘤特异性CTL杀伤效应的影响

目的应用rhIL-18在体外培养系统(Coculture system in vitro,CCs)中诱导肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T Lymphocyte,CTL),探讨IFN-γ在rhIL-18诱导的肿瘤特异性CTL产生过程及杀伤效应中的作用.方法采用Stem SepTM免疫磁性细胞分离法分离人外周血NK细胞、T细胞及DCs细胞,流式细胞仪分析细胞表型,125Ⅰ-UdR标记的细胞毒实验检测杀伤活性,ELISA方法检测IFN-γ蛋白产生量,RT-PCR检测IFN-γ mRNA表达含量.结果在肿瘤抗原存在的条件下,IL-18在CCs中能够诱导并促进CTL介导的肿瘤特异性杀伤效应;IL-18能够在肿瘤抗原刺激的CCs中诱导IFN-γ mRNA的表达及IFN-γ蛋白的产生,并与IL-18的含量呈剂量依赖关系,在rhIL-18含量为100 ng时,培养上清中IFN-γ为4 410±210 pg/ml.但加入抗IFN-γ抗体对rhIL-18诱导的肿瘤特异性CTL产生过程无明显影响,不能抑制IL-18诱导的这种肿瘤特异性CTL的杀伤效应.结论IL-18能够在肿瘤抗原刺激的CCs中有效地诱导CTL介导的肿瘤特异性杀伤效应,并诱导IFN-γ的产生,但其诱导肿瘤特异性CTL的产生过程及杀伤效应与IFN-γ无关.     

pcDNA3.1+/MAGE-3 DNA疫苗诱导特异性抗肿瘤免疫应答的实验研究

目的：构建pcDNA3.1+/MAGE-3 DNA疫苗，观察其在小鼠体内诱导特异性抗肿瘤免疫应答的能力。方法： 通过RT-PCR构建重组表达质粒pcDNA3.1+/MAGE-3；以pcDNA3.1+/MAGE-3 DNA疫苗免疫已接种肿瘤细胞的小鼠，每10 d重复免疫1次，共3次，以pcDNA3.1+、PBS为对照。末次免疫后5 d检测血清中MAGE-3抗体滴度、小鼠脾淋巴细胞的细胞毒T细胞（cytotoxic T lymphocytes，CTL）杀伤活性、细胞因子IL-2和IFN-γ的浓度，同时计算抑瘤率。结果： 成功构建了pcDNA3.1+/MAGE-3 DNA疫苗，用此疫苗免疫已接种B16/MAGE-3细胞的小鼠后，能诱导小鼠脾淋巴细胞MAGE-3特异性的杀伤活性，脾细胞培养上清中细胞因子IL-2和IFN-γ的浓度明显增高，血清中抗MAGE-3抗体在1∶20滴度时阳性，肿瘤生长被显著抑制，与pcDNA3.1+组、PBS组相比，差异显著（P＜0.01）。结论： 成功构建了pcDNA3.1+/MAGE-3 DNA疫苗，该疫苗在小鼠体内既能激活CTL杀伤活性和CD4+ T细胞活性，又能激活体液免疫反应，从而诱导出特异性的抗肿瘤免疫应答。     

共刺激分子4-1BBL基因免疫对HBsAg核酸疫苗诱导小鼠特异性免疫应答的影响

目的 研究共刺激分子4-1BBL基因免疫对HBsAg核酸疫苗诱导小鼠特异性体液和细胞免疫应答的影响.方法 将HBV表面抗原核酸疫苗pcDS2单独或联合共刺激分子4-1BBL质粒肌肉注射免疫C57BL/6小鼠;ELISA法检测小鼠血清抗-HBs IgG及亚型IgG1和IgG2a;迟发型超敏反应(DTH)反应检测体内细胞反应;流式细胞仪检测CD4+ T淋巴细胞分泌IL-4和IFN-γ及CD8+T淋巴细胞分泌IFN-γ水平;流式细胞仪检测小鼠脾细胞HBsAg特异性体外细胞毒性T淋巴细胞杀伤作用(CTL).结果 与单纯免疫核酸疫苗pcDS2组比较,pcDS2和4-1BBL联合免疫组小鼠的抗-HBs水平显著提高,抗-HBs IgG亚类以IgG2a占优;免疫小鼠经HBsAg脚掌皮下刺激后,联合免疫组小鼠脚掌的厚度显著高于pcDS2组;联合免疫组CD4+T淋巴细胞的IL-4和IFN-γ表达水平及CD8+T淋巴细胞的IFN-γ表达水平显著升高;DNA疫苗免疫的各组小鼠,HBsAg特异性体外CIL杀伤作用高于对照组,其中联合免疫组小鼠的体外CTL杀伤作用最强.结论共刺激分子4-1BBL不仅能增强HBV DNA疫苗诱导特异性体液免疫应答,还能增强特异性型细胞免疫反应,尤其增强体内CIL的杀伤活性.     

PIKA佐剂在体内外诱导小鼠免疫应答的探讨

目的：探讨PIKA佐剂在体内外诱导小鼠的免疫应答。方法：体外将小鼠脾淋巴细胞与不同浓度PIKA佐剂培养后，ELISA检测细胞因子IFN-γ、IL-12p40的产生，FACS检测细胞的增殖及活化。体内将PIKA佐剂经小鼠腹腔注射后，检测不同时间点血清中IFN-γ、IL-12pao、IL-6、TNF-α等细胞因子的产生。结果：PIKA佐剂体外呈剂量依赖性诱导小鼠脾细胞产生IFN-γ和IL-12p40。细胞亚群分析的结果表明，PIKA可显著刺激B细胞和NK细胞活化、增殖。体内注射PIKA佐剂后可诱导细胞因子IFN-γ、IL-12pao、IL-6、TNF-α的产生，但产生的时间点不同。结论：PIKA佐剂体内外直接通过诱导细胞因子的产生，B细胞和NK细胞的活化和增殖，而促进免疫应答反应。     

应用rmIL-18 诱导肿瘤特异性CTL 治疗肝癌的实验研究

目的:研究rmIL-18 在体外培养系统(Coculture system in vitro,CCs)诱导肿瘤特异性细胞毒性T 淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte,CTL)及在小鼠体内发挥的抗肝癌效果。方法:采用Stem SepTM 免疫磁性细胞分离方法分离培养小鼠脾脏NK 细胞、T 细胞及DCs,建立体外培养系统;采用不同途径,不同剂量CTL 免疫肝细胞癌荷瘤小鼠,研究CTL 对荷瘤小鼠肿瘤生长速度和生存时间的影响。结果:rmIL-18 能够在体外培养系统中诱导并促进CTL 介导的肿瘤特异性杀伤效应;CTL能够明显抑制荷肝癌小鼠的肿瘤生长速度(P<0.01)及明显延长荷瘤小鼠生存时间(P<0.01),并且这种作用随rmIL-18 浓度的增加而增强(P<0.01),且肿瘤内注射均优于腹腔内注射(P<0.01)。结论:rmIL-18 可以在体外诱导肿瘤特异性CTL 并在小鼠体内发挥抗肝癌作用。     

糖基化磷脂酰肌醇修饰的小鼠IL-21瘤苗抗肿瘤效应及其机制初探

目的 构建糖基化磷脂酰肌醇(glycosyl phosphafidylinositol,GPI)修饰的小鼠IL-21瘤苗,并对此瘤苗的抗肿瘤效应及其机制作初步探讨.方法 通过重叠PCR方法获得IL-21-GPI融合基因并将其插入空载体pcDNA3.1.将鉴定过的重组载体以脂质体法转染B16F10细胞制成瘤苗,细胞间接免疫荧光法及流式细胞仪检测转染瘤细胞膜表面IL-21的表达,通过对小鼠脾细胞的增殖作用鉴定表达的IL-21的生物学活性.将瘤苗接种小鼠后,通过观察小鼠肿瘤体积和生存率分析瘤苗的抗瘤性,并检测了瘤苗免疫鼠的细胞免疫活性.结果 正确构建了pcDNA3.1/IL-21-GPI重组载体,膜表达的IL-21有良好的生物学活性,制备的瘤苗能发挥抗肿瘤效应,其机制与免疫鼠细胞免疫活性增强有关.结论 成功构建了具有抗肿瘤活性的GPI修饰的IL-21瘤苗,为其进一步抗肿瘤免疫治疗研究奠定了基础.     

Effective induction of therapeutic antitumor immunity by dendritic cells coexpressing interleukin-18 and tumor antigen

Dendritic cell (DC) based cancer vaccine can induce potent antitumor immunity in murine models; however, objective clinical responses have been observed only in a minority of cancer patients. To improve the antitumor effect of DC vaccine, Th1-biasing cytokine interleukin (IL) 18 and melanoma-associated antigen gp100 were cotransfected into bone marrow-derived DC (IL-18/gp100-DC), which were used as vaccine to induce the protective and therapeutic immunity in a B16 melanoma model. Immunization with IL-18/gp100-DC resulted in tumor resistance in 87.5% of the mice challenged with B16 cells; however, 12.5% and 25% of mice immunized with gp100 gene-modified DC (gp100-DC) or IL-18 gene-modified DC (IL-18-DC) were tumor free, respectively. Most importantly, IL-18/gp100-DC immunization led to the generation of potent therapeutic immunity that significantly inhibited the tumor growth and improved the survival period of mice bearing established melanoma. Immune cell depletion experiments identified that CD4(+) T cells also played an important role in the priming phase of antitumor immunity and CD8(+) T lymphocytes were the primary effectors. gp100-specific CTL response were induced most markedly in the tumor-bearing mice immunized with IL-18/gp100-DC. Administration with such vaccine also significantly increased the production of Th1 cytokine (IL-2 and interferon-gamma) and induced infiltration of inflammatory cells inside and around the tumors. In addition, natural killer cell activity was also augmented. These results indicate that immunization with DC vaccine coexpressing Th1 cytokine IL-18 and tumor antigen gene may be an effective strategy for a successful therapeutic vaccination.     

注射用布氏菌活疫苗免疫学评价

目的以小鼠为动物模型,通过检测布氏菌活疫苗免疫小鼠产生的体液免疫、细胞免疫应答及保护力,对其进行免疫学评价。方法将30只小鼠随机分为3组,皮下免疫布氏活疫苗,免疫4周后分离血清及脾脏淋巴细胞。ELISA法检测免疫动物血清中总IgG抗体,抗体亚类IgG1及IgG2a;ELISPOT法检测分泌IFN-γ、IL-4的脾脏淋巴细胞数目,以及用ELISA方法检测体外再刺激后小鼠脾细胞分泌IFN-γ、IL-4的细胞因子水平;用羊布氏菌弱毒株M5攻击免疫动物,通过脾脏细菌计数评价布氏活疫苗的免疫保护作用。结果用ELISA法检测到免疫布氏活苗的小鼠体内有特异性抗体产生;ELISPOT可检测到较高的分泌IFN-γ脾脏淋巴细胞数目,ELISA方法可检测到较高的IFN-γ水平,表明布氏活疫苗主要诱导Th1型免疫应答;通过布氏活疫苗保护力分析,表明该疫苗具有较好的免疫保护效果。结论布氏疫苗采用注射免疫途径是可行的,免疫后能获得较好的免疫效果。     

Toxoplasma gondii microneme protein 8 (MIC8) is a potential vaccine candidate against toxoplasmosis

Microneme protein 8 (MIC8) is considered a new essential invasion factor in Toxoplasma gondii. In the present study, a deoxyribonucleic acid vaccine expressing MIC8 of T. gondii was constructed and the immune response it induced in Kunming mice was evaluated. The gene sequence encoding MIC8 was inserted into the eukaryotic expression vector pVAX I, and the pVAX-MIC8 expression plasmid was constructed, and the plasmid diluted with PBS to l00 mg/100?µl was injected into the Kunming mice muscularly. Levels of IgG antibody, gamma-interferon (IFN-γ), interleukin-2 (IL-2), interleukin-4, and interleukin-10 were detected. The mice were challenged with tachyzoites of the virulent T. gondii RH strain at the 14th day after the last immunization to observe the survival time. The high level of IFN-γ, IL-2, and IgG antibody indicated that mice vaccinated with recombinant pVAX-MIC8 plasmid could elicit strong cellular and humoral immune responses and showed a significantly increased survival time (10.3?±?0.9 days) compared with control mice which died within 5 days of challenge infection. These data demonstrate that the T. gondii MIC8 is a potential vaccine candidate against toxoplasmosis.     

The development of IL-17/IFN-γ-double producing CTLs from Tc17 cells is driven by epigenetic suppression of Socs3 gene promoter

The plasticity of T lymphocytes induced by epigenetic modifications of gene promoters may play a pivotal role in controlling their effector functions, which are sometimes causally associated with immune disorders. IL -17-producing T cells, which induce type 17 immune responses, are newly identified pathogenic effector cells. The type 1 signature cytokine IFN-γ strongly inhibits their differentiation, indicating a mutually exclusive relationship between type 17- and type 1-immune responses. However, many reports indicate the presence of a unique IL-17/IFN-γ-double producing T-cell subset in various inflammatory settings, although the mechanisms responsible for their development and their precise functions remain unclear. Here, we demonstrate that IL-12 permits the conversion of mouse IL-17-producing CD8(+) T (Tc17) cells to IL-17/IFN-γ-double producing CD8(+) T (Tc17/IFN-γ) cells, and that this conversion is due to repressive epigenetic modifications of Socs3 gene promoters. Moreover, we show that SOCS3 strongly regulates the capability of Tc17 cells to produce IL-17, in addition to regulating the expression of the type 17-master regulator RORγt. These findings elucidate the mechanisms underlying the conversion of Tc17 cells into Tc17/IFN-γ cells. As these cells are known to have potent antitumor activities, manipulation of these conversion mechanisms for therapeutic tumor immunity may be possible.     

壳聚糖递送的结核基因疫苗诱导的肺部黏膜免疫及在抗结核免疫保护中的意义

诱导肺局部黏膜免疫对于早期控制结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberfulosis)十分关键.在我们过去构建的结核基因疫苗pHSP65pep有效诱导脾脏IFN-γ+Th1细胞应答的基础上,为更好诱导呼吸道和肺局部黏膜免疫,采用天然生物多糖壳聚糖(chitosan)作为黏膜递送介质递送结核基因疫苗.制备壳聚...     

吡喹酮联合IL-18基因治疗血吸虫 感染小鼠对免疫功能的影响

目的 探讨白细胞介素18（IL－18）对吡喹酮治疗后的血吸虫感染小鼠免疫功能的影响对其对虫卵肉芽肿的作用。方法 采用ELISA方法和图像分析技术，分析吡喹酮治疗后血吸虫感染小鼠血清IL－18、γ－干扰素（IFN－γ）、IL－4、转化生长因子β1（TGF－β1）的水平以及虫卵肉芽肿面积和羟脯氨酸水平，在感染后6周，将小鼠IL－18重组腺病毒转染的肝细胞经脾移植到吡喹酮治疗后的感染小鼠，探讨IL－18对小鼠免疫功能的影响及对虫卵肉芽肿的作用。结果 吡喹酮治疗后小鼠血清IL－18、IFN－γ水平明显下降，IL－4、TGF－β1水平虽有所降低，但仍维持在较高水平；同时可见，虫卵肉芽肿面积和肝脏羟脯氨酸含量无明显降低，与同期感染组比较差异均无显著性。IL－18基因修饰的肝细胞经脾移植后能稳定表达IL－18，显著升高IFN－γ水平，明显降低IL－4、TGF－β1水平，减轻虫卵肉芽肿和肝纤维化程度。结论 IL－18基因治疗能有效地发挥抗血吸虫病肝纤维化作用。