CD59基因的突变并真核表达载体的构建

目的 构建两种活性位点相关性CD59突变基因,并重组入真核表达载体.方法 选取物种间高度保守W40位点及相邻位置为突变位点,重叠延伸PCR(Overlap extension PCR)法构建两种CD59基因点突变,一种是编码W40的密码子TGG缺失突变,另一种是C39W40K41→W39W40W41的相应基因突变,各设计两条常规引物和两条反向互补突变引物,以已构建CD59 cDNA为模板,三重PCR 定点诱变扩增突变基因, 重组入克隆载体PMD18-T-Vector, EcoRⅠ单酶切获得目的 基因,重组入真核表达载体pIRES.结果 通过PCR定点诱变成功获得两种目的 CD59突变基因,序列测定及酶切鉴定结果均证实成功构建了pIRES-m1CD59、pIRES-m2CD59重组真核表达载体系统,突变CD59基因长度约500 bp.结论 重叠延伸 PCR法诱变经济可靠,重组质粒的构建为进一步研究CD59的抗补体活性奠定了基础.     

新疆维吾尔族苯丙氨酸羟化酶基因突变分析

目的 了解新疆维吾尔族苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因的突变构成及特点.方法 采用PCR产物直接测序的方法,测定9例维吾尔族苯丙酮尿症(PKU)患者PAH基因全部外显子及其启动子区域序列.结果 在18个PAH等位基因中共检出15个不同的突变基因,检出率为83.3%(15/18),常见突变类型包括R243Q、EX6-96A＞G和R111X,其余突变类型均为散在发生.从维吾尔族中检出的PAH突变基因均系在本民族中首次报道,其中5'-Flanking-480DelACT和5'-Flanking-626 G＞C突变是世界新的PAH基因突变类型.L348V突变是国内未见报道的新突变.结论 研究结果显示维吾尔族PAH基因突变表现出多样性、复杂性和特殊性,具有显著的民族特色.     

多位点酶切联合SSCP方法检测结核杆菌inhA基因突变

目的建立一种简便而有效的方法检测结核分枝杆菌异烟肼耐药基因inhA突变。方法收集结核杆菌临床菌株48株，其中异烟肼敏感株25株，耐药株23株。抽提临床菌株DNA和H37Rv标准株DNA，聚合酶链反应(PCR)方法扩增inhA基因，产物纯化后用限制性内切酶HaeⅡ酶切，酶切片段用单链多态构象分析(SSCP)方法检测其单链构象。发现单链构象改变的PCR产物进行DNA测序。结果48株菌株中，25株敏感株中未见inkA基因单链构象差异，23株耐药株中inkA基因突变率为21．8％。新发现的错义突变有：A26E、R27K、V28A、Q32A、L54V和S72T。结论应用限制性内切酶Hae Ⅱ改良的聚合酶链反应—单链多态构象分析(PCR—SSCP)技术适用于结核临床菌株inhA基因突变的筛选。inhA基因突变位点呈多样性。     

应用酶切富集PCR法检测非小细胞肺癌患者胸腔积液表皮生长因子受体基因突变

目的 探讨酶切富集PCR法检测非小细胞肺癌(NSCLC)患者胸腔积液表皮生长因子受体基因(EGFR)外显子19缺失和外显子21 L858R突变的临床意义.方法 采用EGFR基因突变酶切富集及非酶切富集PCR法对30例NSCLC患者胸腔积液游离核酸EGFR基因外显子19缺失和外显子21 L858R突变进行分析.结果 30例NSCLC患者中,酶切富集PCR法分别检出EGFR基因外显子19缺失10例(33.3%)和外显子21 L858R突变5例(1.7%),非酶切富集PCR法则仅能分别检出6例(20.0%)和1例(3.3%);两种方法检出率差异有统计学意义(P=0.032).在接受吉非替尼治疗的4例患者中,2例检出EGFR基因突变患者治疗后肿瘤均部分缓解.结论 酶切富集PCR法可以高效、经济、准确地检测NSCLC患者胸腔积液游离核酸EGFR基因突变,可能成为临床NSCLC患者选择EGFR酪氨酸激酶抑制剂治疗的预测方法.     

一个May-Hegglin异常家系非肌性肌球蛋白重链9基因突变位点的鉴定

目的：鉴定一个May-Hegglin异常（MHA）家系非肌性肌球蛋白重链9基因（MYH9）突变的类型及临床表型特点。方法：用聚合酶链反应（PCR）技术扩增先证者及其父亲的非性肌球蛋白重链9基因（MYH9）的25、31－32、38、40号外显子,分析PCR产物的核苷酸序列。确定突变位点后,分别扩增正常对照、后天获得性血小板减少症患者的对应基因区域并行核苷酸序列分析以资对照。进而进行PCR扩增片段的CpoI(RsrII）限制性内切酶图谱分析。结果：本家系中May-Hegglin异常患者具有典型的“血小板减少、巨大血小板、粒细胞包涵体”三连征。先证者及其父亲在MYH9的38号外显子上第5521位核苷酸存在G→A突变（GAG→AAG),并导致特征性的CpoI限制性内切酶图谱改变。结论：中国人的May-Hegglin异常存在MYH9基因突变。本家系中,其突变位点位于38号外显子（G5521A）,MYH9基因突变的传递规律与家系中临床表型分布相符。     

蛋白C基因C5498T致Ⅰ型遗传性蛋白质C缺陷症

目的 对一个遗传性Ⅰ型蛋白C(PC)缺陷症家系进行基因突变的检测。方法 分别用ELISA和发色底物法测定血浆蛋白Ｃ活性和抗原。用PCR法对先证者PC基因的9个外显子及其侧翼、内含子2序列进行扩增,PCR产物纯化后直接测序,检测其基因突变。突变位点经限制性内切酶分析证实。结果先证者的蛋白C活性和抗原分别为26％和1．43g／L。先证者表现为PＣ基因外显子3区杂合错义突变Ｃ5498T,引起Arg15→Ｔrp。在基因启动子区存在2405C／T、2418A／G、2583A／T多态性。结论 该突变导致遗传性Ⅰ型PC缺陷症。     

凝血因子X基因复合杂合错义突变Gla26Lys和Ser425Pro导致因子X缺陷症

目的:检测1例凝血因子X(FX)缺陷患者的基因突变.方法:用活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血酶原时间(PT)及FX促凝活性(FX∶C)等测定进行表型诊断;用PCR法对其F10基因8个外显子及其侧翼序列和5'端非翻译区(5'UTR)序列进行扩增,PCR产物纯化后直接测序,检测其基因突变.突变位点经限制性内切酶分析排除多态性.结果:患者APTT 100.0 S、PT 46.6 s、FX:C 2.4%.位于F10基因Exon2内杂合性G8394A错义突变导致Gla(GAG)26Lys(AAG);位于Exon8内的杂合性T28262C错义突变导致Ser(UCC)425Pro(CCC).限制性内切酶分析排除Ser425Pro为多态性.结论:复合杂合性错义突变Gla26Lys和Ser425Pro可能是导致该例患者FX缺陷症的原因.这是2个新的导致FX缺陷症的F10基因突变.     

原发性肌张力障碍患者DYT1基因突变分析

目的 探讨中国人原发性肌张力障碍患者DYT1基因突变分布特点,评价变性高效液相色谱（DHPLC）技术在DYT1基因突变分析中的应用价值。方法 扩增DYT1基因第5外显子片段,利用DHPLC技术对PCR产物进行检测,并测序确认突变类型,同时用PCR-酶切方法检验DHPLC结果。结果在13例原发性肌张力障碍患者中发现5例存在904-906delGAG（3bp）杂合缺失突变,此突变导致302密码子谷氨酸的丢失;DHPLC与酶切方法结果完全一致。结论 DHPLC方法可用于检测DYT1基因3bp缺失突变;DYT1基因GAG缺失突变可能是导致中国人早发性全身型原发性肌张力障碍的主要致病原因。     

应用等位基因特异性PCR检测血管紧张素原基因突变

目的:建立检测血管紧张素原(angiotensinogen,AGT)基因2种常见突变的等位基因特异性PCR技术。方法:应用针对AGT基因T174M和M235T这2种常见的突变位点设计的等位基因特异性PCR技术,对海南汉、黎族人群中AGT基因突变类型进行了检测,同时对经上述等位基因特异性PCR检测的样本进行序列测定。结果:在海南汉、黎族人群中,T174M突变位点可检测出TT、TM、MM 3种基因型,M235T突变位点可检测出MM、MT、TT 3种基因型,用等位基因特异性PCR鉴定的AGT基因突变的基因分型结果与序列测定结果完全符合。结论:等位基因特异性PCR技术操作简便,重复性和稳定性好,可作为鉴定AGT基因突变类型的可行方法。     

VEGF-C真核表达载体的构建及蛋白表达

目的构建人血管内皮生长因子(VEGF-C)编码序列基因真核表达载体,为探讨VEGF-C的生物学功能奠定基础.方法根据已公布的序列设计引物,用PCR方法从肿瘤细胞株cDNA中扩增出人VEGF-C编码序列基因片段,测序正确后用限制性内切酶将目的片段插入PcDNA3.1/V5-His-TOPO载体中.采用酶切和PCR鉴定后通过脂质体介导转染至CHO细胞中进行瞬时表达.结论经RT-PCR扩增转染细胞cDNA和Western blotting检测证实重组质粒pcDNA3.1-VEGF-C能在宿主细胞中高效表达.     

荧光 MGB探针实时 PCR检测经典型苯丙酮尿症的基因突变

【目的】探讨荧光MGB探针实时PCR技术检测经典型苯丙酮尿症的基因突变。【方法】运用荧光MGB探针实时PCR检测经典型苯丙酮尿症33例,一级亲属43例,正常对照30例。检出R243Q突变的PCR标本进行测序验证。【结果】发现11例PKU具有R243Q突变,突变频率为33%,其中突变纯合子4例,突变杂合子7例,一级亲属检出R243Q杂合子突变9例,正常人未发现R243Q突变。所有突变均经测序证实。【结论】PAH基因第7外显子的R243Q点突变在中国PKU患者中有较高的突变率;荧光MGB探针实时PCR是PKU的基因诊断良好技术平台。     

对慢性乙型肝炎及肝硬化患者的核苷（酸）类药物耐药位点的分析

目的 研究接受核苷（酸）类似物抗病毒治疗、出现病毒学突破后的慢性乙型肝炎、肝硬化患者血清乙型肝炎病毒（HBV）P区基因序列突变率,突变形式及用药情况,为评估病情进展和实施下一步抗病毒治疗方案提供较为全面的信息.方法 选取浙江中医药大学附属第六医院2009年3月～2012年10月447例接受核苷（酸）类似物抗病毒治疗、出现病毒学突破后的慢性乙型肝炎、肝硬化患者为研究对象,采用基因直接测序法,对其血清HBV P区基因PCR扩增产物进行测序,分析各个耐药位点,同时搜集相关用药史进行回顾性分析.结果 在447例病例中存在位点突变者227例（50.8％）,共存在30种变异形式,变异形式以M204I、L180M＋ M204V、L180M＋ M204I三者居多.其余种类复杂多样,大多以联合突变形式出现;耐药药物的使用及产生的耐药位点基本一致;主要的变异位点集中发生在M204I和L180M,余均较为分散.且经统计分析,乙型肝炎及肝硬化两总体的突变率有统计学差异.结论 对核苷（酸）类似物抗病毒治疗中出现病毒学突破的慢性乙型肝炎及肝硬化患者血清中HBVP区基因耐药位点的分析研究对合理用药以及发生耐药后及时调整治疗方案有重要的作用.     

两例17α-羟化酶/17,20碳链裂解酶缺陷症分子遗传学研究

目的从分子遗传学方面初步探讨两例17α-羟化酶/17,20碳链裂解酶缺陷症(17OHD)患者的突变性质。方法用患者外周血白细胞DNA进行CYP17A1基因的8个外显子PCR扩增,并通过序列测定确定突变位置和性质。结果两患者均为CYP17A1基因突变的遗传复合体。病例1为Y329K,418X/P428L,病例2为Y329K,418X/P409R,Y329K,418X为插入缺失突变(TAC329AA),导致移码突变,在418位产生终止密码提前终止了蛋白质翻译。结论通过CYP17A1基因突变分析,确诊了两例17OHD患者。     

中国人苯丙氨酸羟化酶基因的10种新突变

目的 研究中国人苯丙氨酸羟化酶(PAH)基因突变的分子基础。方法 应用PCR／SSCP、序列分析等技术,分析中国北方地区120个经典型苯酮尿症(PKU)核心家系,对PAH基因外显子3、5、7、10、11、12进行突变基因的筛查和确定。结果 在确定的31种突变中(另文报道)有10种突变首次在中国PKU人群中发现：165T、S70del、G239D、R241fsdelG、L255S、P281L、G346R、L367fsinsC、R400S和Ivsllnt2t→c。其中4种突变G239D、R241fsdelG、R400S和Ivsllnt2t→c在国际PAH数据库末见公布(至投稿日期)。新突变显示中国人PAH基因虽以点突变为主,但存在小的碱基插入、缺失以及移码突变。新突变主要发生在外显子7中(4／10),每种突变的发生频率均很低(0．42％。1．3％)。结论 中国人PAH基因存在高度异质性和突变的多样性,外显子7是PAH基因的突变热点区域。     

中国维吾尔族人群MBL基因 CGT52TGT、GGC54GAC和GGA57GAA点突变基因频率的研究

目的了解我国维吾尔族人群甘露聚糖结合凝集素(MBL)结构基因外显子1第52、54和57位密码点突变(CGT52TGT、GGC54GAC和GGA57GAA)的情况。方法收集新疆维吾尔族自治区维吾尔族一般人群血标本,提取白细胞基因组DNA,以PCR扩增目的基因片段并应用荧光探针杂交可视技术检测点突变。结果95例维吾尔族样本中,检出54位密码点突变纯合子2例和杂合子28例,未发现CGT52TGT和GGA57GAA点突变。结论维吾尔族人群MBL结构基因CGT52TGT、GGC54GAC和GGA57GAA点突变的频率分别为0、0.168和0。     

儿童四氢生物蝶呤缺乏症患者6-丙酮酰四氢蝶呤合成酶基因突变特点及一种新突变的发现

目的分析四氢生物蝶呤缺乏症(BH4D)患者6-丙酮酰四氢蝶呤合成酶(PTPS)的基因突变特点,为开展BH4D基因诊断提供依据。方法应用PCR-序列分析法对5例疑似BH4D的高苯丙氨酸血症患儿及其父母进行PTPS基因突变检测;应用序列比对和突变蛋白结构分析推测检测到的新突变的性质,同时用人工引入酶切位点的酶切方法对正常人群进行新突变的筛查。回顾性分析患儿的临床表现及实验室检查等相关资料。结果PTPS基因分析共检测出4种突变:N52S、P87S、D96N和L127F;4例患儿的突变基因型为N52S/L127F、P87S/D96N、N52S/D96N和D96N/-。其中L127F突变(c·379C>T)是首次报道的新突变,筛查50例正常儿童未检测到该突变,同时,经序列比对和突变蛋白结构分析,该突变位点在物种进化上是高度保守的。经基因分析和临床资料核实,1例疑似病例排除了6-丙酮酰四氢蝶呤合成酶缺乏症的诊断。结论BH4D患者的PTPS基因突变构成特点与以往国内研究一致。L127F突变可能为致病性突变,与严重的临床表型相关联。     

拉米夫定对乙型肝炎病毒DNA复制及基因变异的影响

目的:研究拉米夫定治疗慢性乙型肝炎(CHB)的疗效、乙型肝炎病毒(HBV)DNA P基因变异特点及编码蛋白质的二级结构.方法:提取HBV DNA后,半巢式聚合酶链反应(PCR)扩增,PCR产物自动测序.总结拉米夫定的疗效、P基因变异出现的时间,用SAS软件分析影响疗效的因素.用DNA STAR软件的CLUSTAL V方法对HBV DNA P基因片段的核苷酸和氨基酸差异、变异类型进行分析.用DNAclub,DNAsis软件分析出现P基因变异前后所编码的蛋白质的二级结构的差异.结果:在治疗后6个月血清标本中未发现YMDD变异,在治疗后12个月血清标本中发现2例YMDD变异.在对照组中发现了1例L528M变异;在治疗后12个月发现了2例YVDD变异,2例只有L528M的变异.在发生变异后,YMDD的转角结构变为折叠,L528M的转角结构没变.结论:1年的拉米夫定治疗可以有效抑制HBV DNA的复制.YMDD变异发生在拉米夫定治疗6个月之后,L528M变异可单独在体内存在,未接受抗病毒治疗的慢性HBV携带者可发生L528M变异.发生YMDD变异的P基因编码的蛋白质二级结构由转角变为折叠.L528M变异不影响蛋白质二级结构.     

PCR产物直接测序检测乙型肝炎病毒耐药变异位点

目的研究采用PCR产物直接测序技术在乙型肝炎病毒(HBV)耐药变异位点检测的特异性和实用性。方法 166例经过核苷类似物治疗至少2年以上的慢性乙肝患者,提取血清HBVDNA,采用巢式PCR扩增,将所得的PCR产物进行琼脂糖电泳检测,阳性PCR产物直接测序。对测序成功的样本进行耐药变异分析。结果 166例中有120例HBV DNA扩增电泳产物阳性,测序确定基因耐药变异位点有40例(24.1%,40/166);其具体分布为:L180M和M204V/I均变异17例(42.5%,17/40)、M204V/I变异lO例(25%,10/40)、N236T变异8例(20%,8/40)、L180M变异3例(7.5%,3/40)、A181V/T变异1例(2.5%,1/40)、A181V/T和N236T变异1例(2.5%,1/40)。120例患者测序确定基因耐药未测出变异位点有80例(66.66%,60/120)例。结论本院核苷类似物治疗2年以上患者,控制病毒疗效并不佳,有24%患者出现基因耐药。PCR产物直接测序法是目前检测HBV耐药变异的一种较好的方法,可用于专科医院临床检测。     

拉米夫定治疗慢性乙型肝炎疗效和基因变异的研究

目的就拉米夫定治疗慢性乙型肝炎(CHB)1a的疗效、HBV DNA P基因变异特点及编码的蛋白质的二级结构加以研究.方法 提取HBV DNA后,经半巢式聚合酶链反应(PCR)扩增,PCR产物自动测序.总结拉米夫定的疗效、P基因变异出现的时间,用SAS软件分析影响疗效的因素.用DNA STAR软件的CLUSTAL V方法对HBV DNA P基因片段的核苷酸和氨基酸差异、变异类型进行分析.用DNAclub、DNAsis 软件分析出现P基因变异前后所编码的蛋白质的二级结构的差异.结果 按照ALT水平分组,各组间促进ALT正常化没有明显差异.在治疗后6个月血清标本中未发现YMDD变异,在治疗后12个月血清标本中发现2例YMDD变异.在对照组中发现了1例L528M变异;在治疗后12个月发现了2例YVDD变异,还发现了2例只有L528M的变异.在发生变异后,YMDD的转角结构变为折叠,L528M的转角结构没变.结论 1a的拉米夫定治疗可以有效抑制HBV DNA的复制.YMDD变异发生在拉米夫定治疗6个月之后,L528M变异可单独在体内存在,未接受抗病毒治疗的慢性HBV携带者可发生L528M变异.发生YMDD变异的P基因编码的蛋白质二级结构由转角变为折叠.L528M变异不影响蛋白质二级结构.     

SOCS超甲基化在经典型慢性骨髓增殖性肿瘤发病中的作用研究

目的探讨细胞因子信号传导抑制蛋白（SOCS）基因超甲基化在经典型慢性骨髓增殖性肿瘤（MPN）发病机制中的作用。方法采用甲基化特异性PCR法检测220例MPN患者骨髓标本中SOCS1、SOCS3基因启动子区CpG岛甲基化发生情况,直接测序法检测MPN患者JAK2V617F、MPLW515L/K基因突变情况。应用粒细胞集落刺激因子化学诱导MPN细胞生长不同时间后,采用实时定量PCR和蛋白印迹法检测SOCS1、SOCS3 mRNA及其蛋白表达情况。同时,加入去甲基化试剂培养MPN细胞不同时间后,实时定量PCR法检测SOCS1、SOCS3 mRNA表达情况。结果 MPN患者中44例（20.0%）存在SOCS1基因超甲基化,90例（40.9%）存在SOCS3基因超甲基化,156例（70.9%）JAK2V617F突变阳性,3例JAK2V617F未突变的原发性血小板增多症患者检测到MPLW515突变（其中2例为MPLW515L,1例为MPLW515K）,2例JAK2V617F未突变原发性骨髓纤维化患者检测到MPLW515L突变;SOCS1、SOCS3基因超甲基化组与未甲基化组相比,其SOCS1、SOCS3 mRNA和蛋白表达量明显减少（P＜0.05）;JAK2V617突变组与无突变组相比,其SOCS1、SOCS3 mRNA和蛋白表达量明显减少（P＜0.05）;SOCS1、SOCS3基因超甲基化组,加入去甲基化试剂后SOCS1、SOCS3 mRNA表达量明显升高（P＜0.05）。结论 MPN患者中存在高频率的JAK2V617F基因突变和低频率的MPL基因突变以及SOCS基因启动子区CpG岛超甲基化;SOCS超甲基化和JAK2V617F突变导致SOCSmRNA和蛋白表达水平降低,异常激活JAK/STAT信号传导通路,引起细胞代谢失常而最终影响MPN的发生、发展;SOCS超甲基化是一种潜在的MPN诊断生物分子标志物及治疗靶标。