大鼠睾丸支持细胞的分离、鉴定与培养

背景与目的:分离培养高纯度的大鼠睾丸支持细胞.材料与方法:选用SD雄性大鼠(18～21 d),处死取出睾丸,采用0.25%胰蛋白酶、0.05%胶原酶二步酶消化法结合低速离心分离支持细胞,置于35℃,5%CO2的培养箱培养,48 h后用20 mmol/LTris-HC1低渗处理培养细胞.0.25%胰蛋白酶消化后二次贴壁培养,用油红0染色和透射电镜观察对所培养的支持细胞进行鉴定,并用MTT法绘制细胞生长曲线.结果:分离培养的支持细胞纯度达95%,体外培养的对数生长期为4～9 d. 结论:采用二步酶消化法与低速离心及低渗处理法分离培养的支持细胞纯度高,用油红0染色鉴定支持细胞是一种简便快速的方法.     

肉苁蓉苯乙醇总苷脂质体对大鼠肝星状细胞增殖、凋亡及细胞周期的影响

目的：研究肉苁蓉苯乙醇总苷（CPhGs）脂质体对大鼠肝星状细胞（HSCs）增殖、凋亡、周期的影响及其相关分子机制。方法：HSCs分为空白对照组和CPhGs脂质体低、中、高浓度（分别为7.36、14.72、29.45 μg/mL）处理组。采用MTT法检测CPhGs脂质体对大鼠肝星状细胞增殖的影响;流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡状况,PI染色法检测大鼠肝星状细胞的周期变化;Western blot检测caspase-3、p27蛋白的表达变化。结果：与空白对照组比较,低、中、高3个剂量的CPhGs脂质体作用于HSCs后,均可抑制细胞的增殖（P < 0.05）;3个剂量的CPhGs脂质体均可促使大鼠肝星状细胞发生凋亡,使细胞阻滞在G0/G1期,上调caspase-3及p27蛋白的表达（P < 0.05）。结论：CPhGs脂质体对体外培养大鼠肝星状细胞有抑制增殖、促进凋亡、阻滞细胞周期的作用。其机制可能与CPhGs脂质体上调caspase-3和p27蛋白表达有关。     

一种简易高效的大鼠原代肝细胞分离方法

目的:寻找一种简易高效的大鼠原代肝细胞分离方法。方法:在Seglen两步胶原酶灌注法的基础上加以改进，按门静脉灌注法分离培养大鼠肝细胞，重复10次分离肝细胞实验，观察各项指标结果。采用胰酶、Ⅳ型胶原酶经门静脉灌注，大鼠肝脏肝门部结构、肝上及肝下腔静脉封闭保留胶原酶消化分离获取肝细胞，经80目和200目的筛网依次过滤细胞后，细胞悬液分别以1 000、500、300 r/min离心各5 min以纯化肝细胞，以台盼蓝排染法测定细胞活性，HE染色鉴定肝细胞纯度。结果:平均每只成年Wistar雄性大鼠可以获得（1.53±0.31）×108个肝细胞，平均获得肝细胞活率可达到94.63%，平均获得肝细胞纯度为96.7%。结论:本实验介绍的方法简便易行，且肝细胞产量较高，活力好，纯度高，适宜在一般条件的实验室推广和应用。     

大细胞肺癌干细胞样细胞的分离及鉴定

目的：从大细胞肺癌组织中分离、鉴定肺癌干细胞样细胞,为进一步研究靶向肺癌干细胞的免疫治疗奠定基础。方法：利用无血清培养基从大细胞肺癌组织中分离、培养肿瘤细胞并建立大细胞肺癌细胞系。流式细胞仪分选表达CD44和（或）CD90的不同肺癌细胞亚群,通过单细胞克隆形成实验、平板集落形成实验、细胞球形成实验及X射线敏感实验研究不同肺癌细胞亚群的生物学特性。结果：应用原代细胞培养技术成功地从大细胞肺癌组织中培养出高纯度的原代肿瘤细胞,命名为LC006细胞,其传代次数可达30代以上。流式细胞仪分析显示, LC006细胞中有1.0%的细胞CD44呈强阳性表达（CD44++）。相比于主群的CD44弱阳性（CD44＋）细胞,CD44++ LC006细胞具有较强的平板集落形成能力,可形成holoclone克隆和细胞球;而CD44＋LC006细胞不能形成holoclone克隆和细胞球。应用CD44和CD90抗体可将LC006细胞分为4个亚群,分别是 CD44＋CD90+（12.8%）、CD44＋CD90-(86.3%)、CD44++CD90+(0.4%)和CD44++CD90-(0.5%)细胞;相比于其他细胞亚群,CD44++CD90+LC006细胞形成细胞球的能力最强,对X射线的抵抗力也最强。结论：成功分离和鉴定的CD44++CD90+LC006细胞是大细胞肺癌的肿瘤干细胞样细胞。     

干细胞样肝原始细胞的分离和鉴定

目的：证实小鼠胎肝中肝干细胞的存在。方法：小鼠胎肝细胞的分离培养和免疫细胞化学等。结果：从小鼠胎肝组织中成功地分离得到了ＡＥＰ、ＣＤ３４及Ａｌｂｕｍｉｎ等特异性分子标记阳性、并呈集落样生长的细胞系。结论：小鼠胎肝中存在具有干细胞性的原始细胞,为肝干细胞生物学特性的进一步认识和利用奠定了基础。     

毛蕊花糖苷对血小板衍生生长因子BB处理后大鼠肝星状细胞的影响

目的：探讨毛蕊花糖苷对血小板衍生生长因子BB（PDGF-BB）诱导的大鼠肝星状细胞（HSC）活化、迁移、胶原沉积、纤维化作用的影响,并进一步探讨其对ERK1/2、Akt信号通路表达的影响。方法：HSC细胞分为毛蕊花糖苷（1.5、3.0、6.0 mg/L）组[重组大鼠PDGF-BB（rrPDGF-BB）预处理24 h后,不同浓度的毛蕊花糖苷干预],PDGF-BB组（rrPDGF-BB预处理24 h,无毛蕊花糖苷干预）,对照组（无rrPDGF-BB预处理,无毛蕊花糖苷干预）;分别采用划痕实验检测细胞迁移能力,ELISA法检测Ⅰ型胶原（Col-I）含量,Western blot检测纤维化HSC活化标志物α-SMA蛋白、凋亡效应分子caspase-3,及ERK1/2、Akt信号通路相关蛋白的表达水平。结果：与对照组比较,PDGF-BB组能促进HSC的迁移（P < 0.01）,毛蕊花糖苷（1.5、3.0、6.0 mg/L）组能明显抑制HSC的迁移（P < 0.01）,且毛蕊花糖苷抑制HSC的迁移有明显的剂量依赖性（r=0.894,P=0.038）;随着受试物浓度的增加,Col-I分泌呈现降低趋势,其中毛蕊花糖苷6 mg/L组抑制胶原产生的作用效果最明显（P < 0.01）;毛蕊花糖苷（1.5,3.0,6.0 mg/L）组能够抑制α-SMA蛋白的表达、激活caspase-3的活性,使ERK1/2、P-ERK1/2、Akt、P-Akt蛋白表达明显降低,且测定蛋白的表达在毛蕊花糖苷各剂量组间也呈现一定的剂量-效应关系（0.826 < r < 0.997,P < 0.01）。结论：毛蕊花糖苷可抑制rrPDGF-BB诱导的HSC的活化、迁移和纤维化作用,其机制可能与毛蕊花糖苷激活caspase-3,阻断ERK1/2、Akt信号通路,抑制HSC中细胞外基质过度沉积及胶原形成有关。     

肝星状细胞与肿瘤肝转移的研究进展

肝脏是人体各类恶性肿瘤易于发生转移的部位,而肝星状细胞（HSC）在肿瘤肝转移中扮演着极为重要的角色。HSC能够促进和构成肿瘤细胞肝转移的微环境,肿瘤细胞又诱导HSC活化,活化的HSC又反作用于肿瘤细胞促其生长,两者双向作用呈现级联扩大效应,最终促进肿瘤侵袭、转移及生长。     

大鼠卵巢颗粒细胞的原代培养与鉴定

背景与目的： 探讨大鼠卵巢高纯度颗粒细胞培养及鉴定的方法,建立一种简便、稳定的细胞模型。 材料与方法： 选用SD雌性大鼠(21～25 d),皮下注射孕马血清促性腺激素(PMSG),48 h后用颈椎脱臼法处死,剖取双侧卵巢,采用机械分离方法释放卵巢颗粒细胞,0.25％胰蛋白酶消化结合低速离心分离细胞,用含15％胎牛血清的DMEM/F12培养基,置于37 ℃,5％ CO2培养箱培养。以HE染色和卵泡刺激素受体(FSHR)免疫组化染色对所培养的卵巢颗粒细胞进行鉴定,用MTT法绘制细胞生长曲线,并检测细胞培养液雌二醇(E2)和孕酮(P)的分泌量。 结果： 分离培养的卵巢颗粒细胞存活率>90％,细胞纯度达到95％以上;体外培养的颗粒细胞对数生长期为48～96 h;颗粒细胞具有正常的分泌雌激素功能,在培养24 h细胞培养液中E2和P的分泌量分别为(10.36±15.89) pg/ml和(77.91± 17.24) pg/ml。 结论： 采用机械分离法结合胰蛋白酶消化及低速离心法分离培养的卵巢颗粒细胞纯度高、活性好,用FSHR表达染色鉴定颗粒细胞是一种简便快速的方法。     

鼻咽癌肿瘤干细胞样细胞亚群的分离及初步鉴定

  目的   分离和鉴定具有肿瘤干细胞特性的鼻咽癌球形成细胞亚群。   方法   利用无血清干细胞球悬浮培养技术从不同分化程度鼻咽癌细胞株中分离成球细胞,然后利用MTT法,软琼脂克隆形成实验,分别评价成球细胞的耐药性、克隆形成能力,最后利用RT-PCR和免疫荧光细胞技术分析干性基因及Wnt信号通路关键转录因子β-catenin在成球及未成球细胞中的表达情况。   结果   低分化鼻咽癌细胞含有较高成球细胞,而高分化细胞株CNE-1中未见成球细胞。与CNE-2相比较,CNE-2S（来源于CNE-2的成球细胞）具有较强的抗肿瘤药物耐药性、克隆形成能力、高表达干性基因,且β-catenin在胞浆和核内都呈高表达。   结论   本研究分离到干细胞样鼻咽癌成球细胞亚群,为最终靶向杀灭鼻咽癌肿瘤干细胞提供了可能。      

干细胞样肝原始细胞的分离和鉴定①

目的:证实小鼠胎肝中肝干细胞的存在.方法:小鼠胎肝细胞的分离培养和免疫细胞化学等.结果:从小鼠胎肝组织中成功地分离得到了AFP、CD34及Albumin等特异性分子标记阳性、并呈集落样生长的细胞系.结论:小鼠胎肝中存在具有干细胞特性的原始细胞,为肝干细胞生物学特性的进一步认识和利用奠定了基础.     

人肺腺癌细胞系中肿瘤干细胞的分离培养及鉴定*

目的：从人肺腺癌细胞系A 549 及H 1299中分离富集含肿瘤干细胞的细胞球并鉴定其生物学特性。方法：用无血清悬浮培养的方法从人肺腺癌A 549 及H 1299细胞株中富集得到肿瘤细胞球。将肿瘤细胞球传代扩增,体外利用CCK-8 法、平皿克隆以及Transwell 小室实验,研究细胞球的增殖情况、自我更新和侵袭转移能力;通过RT-PCR 检测干细胞特异性转录因子Oct4、Nanog基因表达情况;体内利用裸鼠移植瘤形成实验研究肺癌细胞球的成瘤能力。鉴定细胞球的肿瘤干细胞特性。结果：在无血清悬浮培养下,A 549 及H 1299细胞株3~ 6 天后能形成稳定传代的肿瘤悬浮球,悬浮球的体外自我更新、克隆形成和侵袭转移等能力均高于其亲本细胞（P < 0.05）;干细胞核心基因Oct4 和Nanog的mRNA 表达水平明显升高（P < 0.05）;A 549 悬浮球可以明显提高裸鼠体内成瘤能力。结论：通过无血清悬浮培养法可有效富集A 549 及H 1299细胞系中的干细胞成分,该法可成为快速易行构建肺腺癌干细胞模型的方法。     

肉苁蓉苯乙醇总苷对大鼠肝星状细胞TGF-β1/Smad信号通路表达的影响

目的：探讨肉苁蓉苯乙醇总苷（CPhGs）对转化生长因子β1（TGF-β1）介导的大鼠肝星状细胞（HSC-T6）增殖活化作用及对TGF-β1/Smad信号通路表达的影响。方法：试验分为正常对照组、5 ng/mL TGF-β1刺激的HSC-T6模型组、5 ng/mL TGF-β1+不同终浓度（25、50、75和100 μg/mL）CPhGs给药组,另设只加DMEM培养液的空白组。体外培养HSC-T6细胞,通过四甲基偶氮唑盐法（MTT）检测细胞的增殖;LDH比色法测定CPhGs的细胞毒性;采用荧光定量PCR（qPCR）检测Smad2、Smad3和Smad7 mRNA的表达;采用Western blot法检测Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3和Smad7蛋白的表达。结果：与正常对照组比较,TGF-β1模型组显著促进了HSC-T6细胞的增殖,而50~100 μg/mL的CPhGs可以抑制TGF-β1诱导的HSC-T6细胞的增殖（P<0.05）,且25~100 μg/mL的CPhGs对HSC-T6无明显细胞毒性作用;25~100 μg/mL CPhGs均可抑制Smad2和Smad3 mRNA和蛋白水平的表达,且明显抑制Smad2和Smad3蛋白的磷酸化水平,促进Smad7 mRNA和蛋白的表达,差异均具有统计学意义（P<0.05或P<0.01）。结论：CPhGs的抗肝纤维化作用可能与其阻断TGF-β1/Smad通路进而阻断HSC-T6细胞的活化和增殖有关。     

肝星状细胞的免疫学特性

活化的肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSCs）可合成大量细胞外基质（extracellular matrix，ECM），并可分泌转化生长因子p（transforming growth factor-β，TGF-β）、血小板源性生长因子（platelet derived growth factor,PDGF）等促纤维化因子，在肝纤维化的发生发展中起着关键作用。近来研究发现活化的肝星状细胞具有多种免疫细胞的特性，     

一种新的乳腺癌相关抗原的初步分离纯化与鉴定

目的：分离纯化及鉴定一种新的乳腺癌相关抗原。方法：将乳腺癌组织粗提取物进行ＤＥＡＥ－纤维素阶段洗脱,经ＥＬＩＳＡ法检测其特异性蛋白峰,通过ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳和ＥＬＩＳＡ方法进一步纯化及鉴定该抗原,并用酶法,热稳定性检测其理化特性。结果：洗脱的３个蛋白峰中,峰１与乳腺癌患者血清中抗体反应,不与健康妇女、良性乳腺疾病和其它肿瘤患者的血清反应。乳腺癌相关抗原存在于峰１中,分子量为８５ｋＤａ,为糖蛋白。     

建立一种加速剩余肝脏再生的大鼠模型

目的建立一种加速剩余肝脏(future liver remnaut volume,FLR)再生的大鼠模型。方法雄性SD大鼠96只,应用计算机产生随机化数字进行完全随机化分组,分为3组,每组32只,即:肝脏离断+门静脉结扎组(LP+PVL组)、门静脉结扎组(PVL组)和假手术组(Sham组)。评估术后24 h、72 h、7 d和10 d时各组FLR再生率、FLR重量/总肝重、肝功能变化和肝脏组织学改变。结果术后24 h、72 h、7 d和10 d时,LP+PVL组的FLR再生率分别为(29.97±8.86)%、(76.67±9.58)%、(108.61±2.65)%和(117.21±2.66)%,明显高于PVL组(P0.05),FLR重量/总肝重也显示类似变化。LP+PVL组和PVL组的术后肝功能和剩余肝脏组织学检查均显示有一定损害,且以LP+PVL组明显;但两组均于术后10d恢复正常。结论肝脏离断加门静脉结扎能有效促进剩余肝脏再生,术后10 d FLR再生率可达117%、FLR重量/总肝重可达60%。     

人卵巢癌干细胞球的分离与悬浮培养方法

目的：寻找分离培养卵巢癌干细胞球的简便方法。方法：用组织块培养及胶原酶消化法分离培养原代人卵巢癌细胞,分别采用高浓度血清和无血清悬浮培养3~5d后用Percoll液分离悬浮生长的肿瘤细胞球,机械性吹打细胞并进行传代悬浮培养约1个月,采用倒置显微镜观察并用肿瘤干细胞相关抗原（CD44,CD117和CD34）进行免疫细胞化学染色来寻找卵巢癌干细胞标记。结果：采用高浓度血清培养和无血清干细胞培养液均能得到卵巢癌干细胞球。采用胶原酶消化法得到的细胞球相对较多,CD44可能是卵巢癌干细胞较特异的抗原标记。结论：高浓度血清培养能获得一定数量的肿瘤干细胞球,用Percoll液分离纯化肿瘤细胞球是一种简便的好方法。卵巢癌干细胞球多表达CD44抗原标记。     

神经母细胞瘤原代培养及细胞类型意义的研究

目的:应用骨髓转移标本及原发肿瘤建立神经母细胞瘤原代培养细胞并鉴别N、S和I型细胞,根据细胞集落形成及特征经过提示不同种类细胞与神经母细胞瘤临床预后之间的关系.方法:应用体外原代培养技术对8例骨髓转移神经母细胞瘤患儿骨髓液及4例神经母细胞瘤手术切除肿瘤进行原代细胞培养,观察培养细胞形态学特点,应用Western blot法检测特异性标志物的表达以区分N、S和I型细胞,并应用细胞集落形成实验检测不同类型细胞所致集落形成情况,结合临床治疗及预后结果来评价N、S和I型细胞在神经母细胞瘤中的不同作用及对预后的指示作用.结果:N型细胞呈现聚集生长、核浆比例增大,轴突生长;S型细胞呈单层生长、胞体大而扁平,无轴突突起;I型细胞兼有以上两种细胞特点.I型细胞形成集落的数鼍高于N型细胞,而s型细胞并未形成集落.临床预后中N型及I型临床进展快,预后差,3年生存率为1/5及0(0/4);而s型临床有自发消退逆转迹象,预后良好,3年生存率为3/3.结论:神经母细胞瘤细胞类型包括N、S及I型,I型细胞具有肿瘤干细胞特点,可同时表达N及S型细胞的特异标志物且具有较强形成集落的能力,临床提示预后极差.N型细胞形成集落能力较I型细胞弱,且临床预后不良,而S型细胞无集落形成,临床预后良好.     

应用长春新碱分离与鉴定U87细胞系中的胶质瘤干细胞

背景与目的:研究表明,肿瘤干细胞具有化疗抵抗性.本研究拟利用肿瘤干细胞对化疗药物耐受的特性,在培养基中添加长春新碱的方法从人胶质瘤细胞系U87中分离鉴定肿瘤干细胞.方法:U87细胞于含血清培养基中贴壁后,换用含有5 ng/ml长春新碱的神经干细胞培养基培养,获得第一代肿瘤细胞球后,将单细胞接种于神经干细胞培养基中,获得第二代肿瘤细胞球.免疫荧光检测巢蛋白(nestin)、胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、β-微管蛋白Ⅲ(β-tubulin Ⅲ)、髓鞘碱性蛋白(myelin basic protein,MBP)在第二代肿瘤细胞球及其分化细胞中的表达.结果:成功地获得了第一代肿瘤细胞球以及来源于单细胞的第二代肿瘤细胞球;细胞间紧密相贴,表面较光滑;神经干细胞标志物nestin在第二代肿瘤细胞球中呈阳性表达;第二代肿瘤细胞球分化细胞中可检测到nestin、GFAP、β-tubulin Ⅲ、MBP的表达.结论:U87细胞系中存在具有自我更新及多向分化能力的胶质瘤干细胞,采用神经干细胞培养基中添加长春新碱的方法能简单有效地从胶质瘤细胞系中分离培养出胶质瘤干细胞.     

不同转移潜能癌细胞亚系分离鉴定和细胞克隆模型建立及在转移机理研究中应用

我们以三个转移性癌细胞系为基础从每个转移性癌细胞系中分离出不同转移的克隆细胞株，并进行了鉴定，建立I较稳定的不同转移潜能癌细胞亚系和细胞克隆模型。利用这些克隆细胞株进行了各自与转移性相关因素的研究；转移性癌细胞的丝状伪足内内质网结构、细胞内骨架系统及缝隙连     

一种简单γδT细胞扩增培养方法及其抗肿瘤生物学功能研究

目的 :建立一种特异快速地诱导扩增人外周血γδT细胞的方法 ,并比较了γδT细胞 ,NK和LAK细胞的抗肿瘤的生物学特性。方法 :收集用不同单抗分别包被粘附的细胞 ,然后通过MACS细胞分选仪的分选 ,获取的细胞进行细胞增殖动力学、细胞表型、细胞杀伤活性的测定以及单抗阻断效应的分析。结果 :经MACS分离得到的γδT细胞 ,培养 2周后细胞数扩增 6 0 0～ 80 0倍 ,CD3,CD8和γδ细胞表达阳性率分别是 72 .2 9% ,5 8.0 2 %和 6 5 .98%。γδT细胞对NK敏感细胞K5 6 2以及NK不敏感细胞Raji和XG 7这 3种不同靶细胞均有较高的杀伤率 ,分别为 35 .98% ,5 2 .2 7%和 6 9.0 8% ;NK细胞对此 3种细胞的杀伤率分别是 45 2 1% ,12 .34%和 11.94% ;LAK细胞的杀伤率分别为 44 .0 1% ,2 9.2 7%和 2 5 .6 8%。γδT细胞对经MHC Ⅰ类单抗阻断前后的K5 6 2 ,Raji和XG 73种靶细胞的杀伤率无明显改变。结论 :γδT细胞、NK细胞和LAK细胞都具有一定的非特异性杀伤肿瘤细胞的作用 ;γδT细胞对MHC Ⅰ类单抗阻断后的肿瘤细胞的杀伤无明显变化。提示γδT细胞较NK细胞和LAK细胞有更广泛的抗瘤谱