淋病奈瑟菌rmp基因缺失突变株的构建及其抗体杀菌作用研究

目的研究淋病奈瑟菌的外膜蛋白Rmp在免疫阻抑中的作用及其消除策略。方法PCR扩增淋病奈瑟菌rmp基因,将rmp中间200个核苷酸残基用卡那霉素抗性基因Kan取代,含rmp两侧侧翼区和Kan的DNA片段△rmp∷Kan转化淋病奈瑟菌 WHO-A菌株,PCR和Western blot 鉴定野生rmp被突变基因（△rmp∷Kan）取代并不能表达Rmp的突变株。突变株免疫小鼠,并用抗体介导的补体杀菌作用研究免疫血清的抗菌活性。结果构建了rmp基因缺失的淋病奈瑟菌突变株,突变株诱生的抗体具有更强的杀伤淋病奈瑟菌活性。结论淋病奈瑟菌rmp基因缺失突变株可能消除了野生株中Rmp的免疫阻抑作用,在新型全细胞减毒活疫苗研制中具有潜在应用价值。     

淋病奈瑟菌TetM耐药基因的检测及质粒介导耐药性的分析

目的 建立淋病奈瑟菌TRNG株的PCR检测方法并对淋病奈瑟菌质粒介导的耐药性进行调查与分析。方法 通过特异的引物设计,行PCR扩增、电泳,可以检测出淋病奈瑟菌的TRNG株。同时通过琼脂稀释法检测153株淋病奈瑟菌对青霉素及四环素的MIC值。结果 153株淋病奈瑟菌中,通过最小抑菌浓度测定为TRNG株的83株菌,其PCR法结果均为阳性,其余为阴性。用质粒总量或菌悬液作为检测模板,其最低检出率分别为0.1pg和100个菌细胞。淋病奈瑟菌质粒介导的耐药性调查显示：质粒介导的耐药率为87％,其中PPNG71％,TRNG54％,PPNG／TRNG39％。PPNG／TRNG株已成为成都地区主要流行菌株。结论 TRNG株PCR检测方法具有很高的特异性和灵敏度。与传统方法相比,其简便、快速、准确,可以在一般实验室运用。成都地区质粒介导的耐药性保持高水平并呈上升趋势,应该引起有关部门的高度重视。     

淋病奈瑟菌临床菌株外膜蛋白PIA基因序列分析及原核表达系统的构建

目的： 分析本地区淋病奈瑟菌临床菌株外膜蛋白PIA基因核苷酸及氨基酸序列，构建PIA基因的原核表达系统。方法：采用高保真PCR扩增9株淋病奈瑟菌全长PIA基因序列，T-A克隆测序后与GenBank公布的序列进行同源性比较。构建PIA原核表达系统。采用不同浓度IPTG诱导重组目的蛋白rPIA表达，10%SDS-PAGE和Bio-Rad凝胶图像分析系统检测rPIA表达情况。采用Ni-NTA亲和层析法提纯rPIA，SDS-PAGE检测提纯效果。结果： 与报道的PIA基因序列（GenBank No: L19962）比较，9株淋病奈瑟菌核苷酸和氨基酸序列相似性分别高达99.6%-100%和99.1%-100%，均属于IA6血清型。rPIA表达量可占细菌总蛋白量的50.1%，提纯后仅显示单一的目的蛋白条带。结论： IA6为本地区淋病奈瑟菌优势血清型，该基因序列相当保守。所构建的PIA基因原核表达系统能高效表达rPIA，为今后研制淋病奈瑟菌血清学检测试剂盒及疫苗研制奠定了基础。     

产青霉素酶淋病奈瑟菌的基因检测

目的 了解常州地区产青霉素酶淋病奈瑟菌（penicillinase-producing Neisseria gonorrhoeae,PPNG)在淋病奈瑟菌中的构成比。方法 用套式聚合酶链反应（nested polymerase chain reaction,nPCR)对分离自常州地区的81株淋病奈瑟菌进行PPNG特有耐药基因检测。结果 81株淋病奈瑟菌中有62株检出耐药基因，即PPNG已占淋病奈瑟菌总数的76.5%。结论 常州不仅存在PPNG，而且已构成流行。     

淋病奈瑟菌NspA基因疫苗诱导小鼠特异性体液免疫应答

1999年Martin等首先克隆了淋病奈瑟菌表面蛋白A（Neisseria surface protein A，NspA）基因，发现其在细胞表面持续表达，菌株之间NspA氨基酸序列的同源性高达98％，提示NspA可能是研制淋病疫苗的理想抗原。我室已成功构建NspA真核表达载体pcNspA，本文研究了pcNspA基因免疫在小鼠体内诱生特异性抗体的作用。     

二家医院肺炎克雷伯菌连续分离株质粒AmpC基因研究

目的了解不同医院间肺炎克雷伯菌连续分离株质粒AmpC基因存在情况和耐药性。方法应用聚合酶链反应（PCR）法对耐药的肺炎克雷伯菌连续分离株进行AmpC酶DHA和ACT-1基因检测和分析。结果PCR结果显示A院44株肺炎克雷伯菌中DHA基因阳性4株（9．1％）；B院25株肺炎克雷伯菌中DHA基因阳性8株（32．0％），ACT-1基因二家均为阴性，二家医院DHA基因检出率有明显差别（P〈0．05）。结论质粒型AmpC酶基因可通过转化、接合等方式转移给其他同种或不同种菌，易于传播。二家医院DHA基因检出率有明显差别，并均己有流行的迹象。     

革兰阴性菌qnrA基因介导的喹诺酮耐药分子机制研究

目的了解革兰阴性菌质粒介导qmA耐药基因的发生率、分子遗传学背景及其阳性株的耐药谱。方法收集2004年4月-2006年4月对萘啶酸耐药的临床分离无重复株共629株，采用特异引物PCR结合测序进行qnrA阳性株的识别，表型确认试验结合PCR检测识别产ESBL或AmpC酶的qnrA阳性株，Kirby-Bauer法和Etest法进行qnrA阳性株的药敏检测，质粒接合转移及Southem杂交检测进行qmA基因的质粒定位，PCR策略克隆携带qnrA基因整合子基因结构并进行引物步移测序。结果qnrA阳性株的总检出率为1.9％（12／629）。菌种分布为肺炎克雷伯菌2．2％（3／138），阴沟肠杆菌17．1％（6／35），产气肠杆菌9．1％（1／11），枸橼酸杆菌属12．5％（1／8），沙门菌属14．3％（1／7）。qnrA基因定位在80～180kb大小质粒上的su／1型Ⅰ类整合子基因结构中。其中4株菌qnrA基因定位在整合子In37上，另外8株菌qnrA基因定位在一种新型的整合子InX上。所有qnrA阳性株均产ESBL，并具有可转移多重耐药的特征。结论广东地区喹诺酮抗菌药耐药株中存在着质粒介导的耐药机制，但发生率较低；其耐药基因qnrA的水平传播能力有可能导致细菌耐药性的播散。     

常见肠杆菌科细菌临床株aac（6′）-Ib-cr基因的流行现状和耐药特征

目的研究氨基糖苷乙酰胺转移酶基因的突变形式aac（6′）-Ib-cr在肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌临床株中的分布状况;分析携带该基因菌株对环丙沙星、氨基糖苷类和头孢菌素类的耐药特征。方法利用多聚酶链式反应检测肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌临床分离株中aac（6′）-Ib-cr基因携带情况,采用BtsCI酶切消化,经DNA测序确认aac（6′）-Ib-cr基因;统计分析aac（6′）-Ib-cr基因与环丙沙星、头孢菌素类和氨基糖苷类耐药性关系。结果aac（6′）-Ib-cr基因在肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌的检出率分别为12．6％（30／238）和18．8％（13／69）;aac（6′）-Ib-cr阳性株与阴性株对环丙沙星的耐药率分别为72．1％（31／43）和48．1％（127／264）,差异有统计学意义（x2=8．52,P〈0．05）。肺炎克雷伯菌aac（6′）-Ib-cr基因阳性株对阿米卡星的耐药率高于aac（6′）-Ib-cr基因阴性株（x2=4．25,P〈0．05）。aac（6′）-Ib-cr基因阳性株和阴性株对庆大霉素的耐药率、常用的头孢菌素类的耐药率和多重耐药率均较高,无统计学差异。结论本地区肺炎克雷伯菌和大肠埃希菌临床分离株中,aac（6′）-Ib-cr基因均有检出;aac（6′）-Ib-cr基因阳性株对环丙沙星耐药率明显高于阴性株,肺炎克雷伯菌中aac（6′）-Ib-cr基因阳性株对阿米卡星的耐药率明显高于阴性株,具有统计学意义。aac（6′）-Ib-cr基因阳性株和阴性株对常用头孢菌素类的耐药率和多重耐药率均较高,无统计学意义。     

表皮葡萄球菌双组分信号转导系统arlS基因生物学功能研究

目的探讨表皮葡萄球菌arlSIR双组分信号转导系统（two-component signal transduction system，TGS）的组氨酸激酶arKS基因删除对细菌生物学的影响。方法构建含有红霉素抗性基因（ermB）的pBT2-AarlS质粒，随后将电转入表皮葡萄球菌1457的重组质粒在43℃条件下振摇培养，筛选表皮葡萄球菌1457菌株的ads缺失突变株（SEl457-△arlS）；采用微量板半定量方法检测arlS删除突变对细菌生物被膜形成的影响，通过检测A595值观察其生长曲线，检测过夜培养上清液对菌细胞裂解均活性，并用0．1％Triton X-100诱导细菌自溶的方法检测SEl457-△ar／S突变株的自溶情况。结果成功构建pBT2．AarLS质粒，利用同源重组基因删除的方法表皮葡萄球菌1457 arlS基因被删除。AarlS突变株与野生株的生长曲线基本相似，提示adS基因删除对细菌的增殖无明显影响，但SEl457．AadS突变株形成生物被膜的能力明显低于野生株，降低90．96％；在0．1％TritonX-100诱导下SEl457．△arlS基因删除突变株的裂解率为97．83％，野生株为55．38％；而△arlS突变株过夜培养上清液对靶细菌裂解的活性则低于野生株，其裂解率为20．50％，野生株为56．12％。结论表皮葡萄球菌arLS／R双组分信号转导系统arlS基因可调控细菌生物被膜形成、菌细胞自溶以及胞外细菌裂解酶的活性。     

产青霉素酶的48株淋病奈瑟菌的耐药性、质粒特征及酶切分析

目的　了解产青霉素酶淋病奈瑟菌（ＰＰＮＧ） 株的耐药性特征、耐药与质粒携带类型之间的相互关系以及追踪耐药菌株的来源。方法　对本地区１９９６ 年５ ～７ 月分离的４８ 株ＰＰＮＧ 标本进行了分析。用琼脂扩散法和琼脂稀释法测定标本对１１ 种抗生素的敏感性。碱变性加溶菌酶法对标本进行质粒抽提。电洗脱法回收５－３ｋｂ 和７－４ｋｂ 质粒，用Ｂａｍ ＨⅠ单切酶和Ｂａｍ ＨⅠ＋ Ｐｓｔ Ⅰ、Ｂａｍ ＨⅠ＋ ＢｇＬⅠ双切酶酶切分析。结果　４８ 株ＰＰＮＧ 株对青霉素Ｇ、四环素和氟哌酸耐药率较高，分别为１００ ％ 、９３－７ ％ 和８９－５８ ％ ，对其余抗生素较敏感。４８ 株ＰＰＮＧ 菌株中４７ 株被检出耐药性质粒，但耐药性质粒酶切片段多少不一，具有明显的多态性。结论　耐药性质粒酶切分析为追踪耐药性质粒来源及耐药菌株的流行趋势提供了流行病学信息。     

88株嗜麦芽窄食单孢菌氨基糖苷类耐药性及其修饰酶基因分析

目的明确2005年8月至2007年7月临床分离的88株嗜麦芽窄食单孢菌对氨基糖苷类抗生素的耐药性及其修饰酶基因的存在状况。方法用Kirby—Bauer（K-B）药敏试验分析88株嗜麦芽窄食单孢菌对3种常用氨基糖苷类抗生素阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素的敏感性，再用聚合酶链反应（PeR）法分别扩增常见的8种氨基糖苷修饰酶基因。结果这88株嗜麦芽窄食单孢菌同时对3种氨基糖苷类抗生素都耐药的有19株．占21．6％（19／88）；同时对这3种抗生素都敏感的有12株，占13．6％（12／88）；对阿米卡星，庆大霉素和妥布霉素的耐药率分别为22％，69．3％和58％，敏感率分别为70％，22．7％和23．9％。氨基糖苷修饰酶基因aac（3）-Ⅰ和ant（4′）-Ⅱ未检测到；其余6种基因中，aac（3）-Ⅱ，ant（2′′）-Ⅰ，aae（6′）-I，aae（3）-Ⅲ，aae（3）-Ⅳ和aac（6′）-Ⅱ）的检出率分别是2．3％，5．7％，8％，11．4％，11．4％和12．5％。结论临床分离的嗜麦芽窄食单孢菌对氨基糖苷类修饰酶携带率不是很高，但氨基糖苷类抗生素耐药情况却很严重。     

变异链球菌F-ATPase亚基β基因多态性及表达研究

目的研究变异链球菌（Streptococcus燃，简称变链菌）临床分离株耐酸因子F-AT—Pase亚基B结构基因uncD的遗传多态性和mRNA表达水平差异，探讨其与细菌耐酸力的关系。方法实验株包括18株高耐酸和20株低耐酸变链菌临床株，以特异引物从细菌组DNA扩增uncD，行限制性内切酶长度多态性分析（RFLP）和测序比较；应用半定量RT-PCR两步法和凝胶成像系统定量软件，对20株不同基因型和不同耐酸力变链菌uncD基因的mRNA表达水平进行评价和比较。结果AluI—RFLP产生A、B基因型，测序证实导致多态出现的基因变异不在uncD的功能区和催化结构域；这两种基因型在不同耐酸力菌株的分布不同（P〈0．05），高耐酸性菌株中A型基因uncD的检出高于低耐酸力菌株。不同耐酸力菌株uncD的mRNA表达水平不同（P〈0．05），但A、B两基因型菌株uncD的mRNA表达差异没有统计学意义（P〉0．05）。结论F-ATPase的β亚基基因具有明显的遗传多态性，基因型和mRNA表达水平的多态性与菌株的耐酸力有一定的关系，虽然β亚基基因功能区高度保守，但在酸耐受适应中，仍表现为F—ATPase较活跃上调的亚基基因。     

ICU中MRSA耐药基因检测及其PFGE分型

目的对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）菌株进行分子分型,探讨ICU中MRSA医院感染的特点和流行规律。方法采用表型筛选和PCR扩增mecA基因方法鉴定MRSA菌株。脉冲场凝胶电泳方法（PFGE）进行分子分型。结果12株金黄色葡萄球菌表型筛选为MRSA,MRSA产生A型、B型、C型和D型4种耐药表型,优势耐药模式是A型（75．0％）,MRSA对苯唑西林、阿莫西林／克拉维酸和氨苄西林／舒巴坦等10种抗生素产生100％耐药性,11株MRSA携带mecA基因,携带率为91．7％,PFGE指纹图谱分两型,分别为R1型和R2型,11株MRSA为R1型（91．7％）,R1型各株间相似度为100％。结论ICU可存在MRSA爆发流行,MRSA产生多重耐药性（MDR）,MRSA携带mecA基因可表现为MDR,PFGE分型是理想的分子流行病学溯源手段。     

148例新生儿眼结膜炎与产妇阴道病原感染相关性的分析

目的了解自然分娩产妇产道细菌性感染（不包括衣原体）对于新生儿眼结膜炎的发病影响，加强围产期保健，防止婴幼儿视力损害。方法对148例新生儿眼结膜炎患者作结膜囊渗出物细菌培养和药敏试验，根据培养结果将患儿分为A组：培养阴性（无菌生长）组，B组：培养阳性组（有菌生长），同时相应将A组、B组患儿母亲分为产妇A组和产妇B组，作阴道分泌物涂片革兰染色检查相对照。结果产妇A组检出病原菌者5例（17．2％），清洁度正常，未检出病原菌及滴虫者24例（82．8％）。患儿B组检出淋病奈瑟氏菌13株（10．9％），其它各属菌株106株（89．1％）。产妇B组涂片见有白细胞内外革兰阴性双球菌者11例（9．2％）；其它病原菌及念珠菌、滴虫感染者76例（63．9％），清洁度正常，未检出病原菌及滴虫者32例（26．9％）。产妇A组产道感染阳性率17．2％，B组阳性率73．1％，两者比较差异有极显著性（P〈0.001）。结论新生儿眼结膜炎与产妇产道感染有密切相关性，应加强对妊娠中晚期孕妇的生殖道感染防治，减少新生儿经产道感染的几率。     

VNTR技术用于安徽省耐药结核分支杆菌基因分型的初步研究

目的 探讨VNTR（variable number of tandem repeat）技术在安徽省耐药结核分支杆菌基因分型中的应用。方法初步选取13个分型效果较好的VNTR基因位点。应用聚合酶链反应（PCR）和琼脂糖凝胶电泳，建立检测耐药结核分支杆菌DNA指纹多态性的方法，分析耐药结核分支杆菌DNA多态性。结果共对78株耐药结核分支杆菌的13个VNTR位点进行了检测，根据这些菌株的指纹多态性特征，共分为4个基因型（Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅳ型），分别为Ⅰ型3．8％（3／78）、Ⅱ型6．4％（5／78）、Ⅲ型10．3％（8／78）、Ⅳ型所占比例最大，为79．5％（62／78）。在Ⅳ型菌中，耐药菌株主要为耐多药（结核分支杆菌至少耐异烟肼和利福平两种药）和单耐利福平菌株，其所占比例分别为45．8％和22．6％。结论本资料分析表明，安徽省耐药结核分支杆菌的传播似以Ⅳ型菌株为主，应加强此型菌株流行的监控。     

蒙族和汉族人群 CYP1A1基因MspⅠ位点的多态性

目的研究内蒙古地区蒙族和汉族人群CYP1A1基因Msp Ⅰ位点的多态性。方法应用聚合酶链反应．限制性片段长度多态技术对无血缘关系的80名蒙族和120名汉族个体的基因型进行分析。结果内蒙古地区蒙族和汉族人群CYP1A1基因wt／wt、wt／vt和vt/vt 3种基因型的频率分布分别是：蒙族35．0％、48．7％、16．3％和汉族33．3％、52．5％、14．2％。两者之间经X^2检验差异无统计学意义（P〉0．05）。结论内蒙古地区蒙族和汉族人群CYP1A1 基因Msp Ⅰ的基因型频率分布无明显差异。     

高脂血症高密度脂蛋白亚类分布与Apo A-Ⅰ基因多态性的关系

目的：探讨高脂血症患者高密度脂蛋白（HDL）亚类分布与载脂蛋白A-Ⅰ(Apo A-Ⅰ)基因多态性的关系。 方法： 采用聚合酶链反应(PCR)-限制性片段长度多态性(RFLP)和双向电泳-免疫印迹检测法，分析比较118例高脂血症患者和109例血脂正常者的Apo A-Ⅰ基因型、HDL各亚类分布及相对含量。 结果： Apo A-Ⅰ基因 －78 bp 位点和 ＋83 bp 位点的多态性分别以G/G和C/C基因型占优势，其中 －78 bp 位点高脂血症组A等位基因的频率显著高于对照组（P＜0.05）。高脂血症患者中，G/A突变受试者血清TG、Apo C-Ⅲ、pre β1-HDL及HDL3a水平显著高于，而HDL2a和HDL2b水平则显著低于G/G基因型者。 结论： 高脂血症Apo A-Ⅰ基因 －78 bp 位点G/A突变与HDL亚类分布相关，G/A突变受试者血清HDL亚类颗粒呈减小的趋势，提示HDL成熟代谢可能受阻。     

转座子tnpU基因在多重耐药革兰阴性杆菌中的分布情况

目的研究转座子tnpU基因和β-内酰胺酶在多重耐药革兰阴性杆菌中的分布情况。方法用纸片扩散初筛试验、扩散确证试验进行超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）表型检查,头孢西丁三维试验进行AmpC β-内酰胺酶的表型检查,纸片协同试验筛选产金属β-内酰胺酶（MBL）菌株;用多重聚合酶链反应（PCR）技术扩增转座子tnpU基因,并进行DNA测序;用MIC药敏法分析多重耐药革兰阴性杆菌的药物敏感性。结果转座子tnpU的总检出率为25．5％。在各菌种的检出率分别为大肠埃希菌占6.3％（3株）、肺炎克雷伯菌占8．3％（1株）、鲍曼不动杆菌占33-3％（20株）、铜绿假单胞菌占43．2％（16株）;β-内酰胺酶表型检测中,ESBLs的检出率最高,转座子tnpU基因阳性的菌株大多数B．内酰胺酶表型为阳性;转座子tnpU基因阳性菌株对抗生素的耐药率显著高于转座子阴性菌株（P〈0．05）。结论转座子tnpU基因在非发酵菌中的分布较广泛,可能在多重耐药机制中起重要作用。     

MLVA和Spoligotyping用于西藏地区216株结核分枝杆菌临床分离株的基因分型研究

目的评价间隔区寡核苷酸分型（Spoligotyping）及多位点可变数量串联重复序列分析（MLVA）两种分型方法在西藏地区结核病分子流行病学中的应用。方法收集西藏地区结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis）临床分离株，应用Spoligotyping及MLVA两种分型方法进行比较分析。结果共在西藏地区收集到216株结核分枝杆菌临床分离株，采用Spoligotyping分型方法，216株菌可分为3个基因群13种基因型，其中最大的1个基因群即北京家族（8eijingfamily）含有195株菌，占90．28％。北京家族菌株中，有BCG接种史者占45．64％（89／195），无BCG接种史者占54．36％（106／1195），两者间的差异无统计学意义（X^2=0．059，P〉0．05）。采用MLVA分型方法，216株菌可分成19个基因群108种基因型，其中80种基因型只有1株菌，占37．03％（80／216），另有136株菌表现出28种基因型，成簇数为28，占62．96％（136／216）。在20个VNTR位点的等位基因多态性发现Miru31位点的多态性最高，多态性指数（h）达到0．77，而Mtub29、Mtubl2位点的多态性较差，都低于0．05。其中Mtuh02位点可鉴别北京家族和非北京家族，它鉴别的北京家族与Spoligotyping鉴别的北京家族符合率达到100％。结论西藏地区结核分枝杆菌具有明显的接引多态性，其主要流行型为北京家族。北京家族菌株与BCG接种无相关性。应用Spoligotyping和MLVA两种分型方法进行结核病流行病学研究，将提高结核病的流行病学调查和病原学监测效果。     

多重PCR对金黄色葡萄球菌杀白细胞素基因的检测

目的应用多重PcR检测含Panton-Valentine杀白细胞素（PVL）基因的金黄色葡萄球菌。方法收集我院2005年1月至2006年1月从临床多种标本中分离的金黄色葡萄球菌，用多重PCR同时检测葡萄球菌16SrRNA基因、mecA基因和lukS/F-PV基因。多重PCR检测MRSA的SCCmec基因型及亚型。结果195株金黄色葡萄球菌经多重PCR检测，121株为耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA），74株为甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA），共检测到26株金黄色葡萄球菌lukS/F-PV基因阳性，阳性率为13．3％（26，195）。其中19株为MRSA，阳性率为15．7％（19／121）；7株为MSSA，阳性率为12．2％（7／74）。19株lukS/F-PV基因阳性的MRSA的SCCmec基因型分别为SCCmec Ⅲ型10株、SCCmecⅢA型4株、SCCmecⅣ型4株及SCCmecⅠ型1株。26株lukS/F-PV基因阳性的分离株有11株分离自脓液或创面分泌物，10株分离自痰标本，3株分离自血液标本，2株分离自尿液。结论在温州地区分离的MRSA和MSSA中都能检测到Panton-Valentine杀白细胞素基因，含Panton-Valentine杀白细胞素基因MRSA的SCCmec基因型主要为SCCmec Ⅲ，含PVL基因的金黄色葡萄球菌主要引起化脓性感染和肺部感染。