抗丙酮酸脱氢酶复合体E2亚基单克隆抗体的制备与鉴定

目的 制备抗人丙酮酸脱氢酶复合体E2亚基(pyruvate dehydrogenase complex E2,PDC-E2)的单克隆抗体(mAb)并进行初步鉴定.方法 将正常成人肝组织匀浆离心并分离线粒体,用线粒体总蛋白免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术制备mAb,并通过间接ELISA法、Western blot及免疫组化的方法对mAb进行特性鉴定,通过免疫沉淀联合质谱、Uni-ZAP XR肝脏cDNA表达文库筛选鉴定抗原.结果 获得1株可稳定分泌抗人PDC-E2 mAb 的杂交瘤细胞系.mAb的Ig亚类(型)为IgG1(κ), 该mAb可用于ELISA检测、Western blot、免疫组化和免疫沉淀实验.结论 成功制备了抗人PDC-E2的mAb,为PDC-E2的研究提供了有力的工具.     

氨甲酰磷酸合成酶单克隆抗体的制备、鉴定及应用

目的:制备抗人氨甲酰磷酸合成酶(CPSI)的单克隆抗体(mAb)并进行初步鉴定与应用.方法:将正常成人肝组织匀浆离心并分离线粒体,用线粒体总蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备 mAb,并通过间接ELISA法、Western blot、免疫组化及免疫荧光染色的方法对mAb进行特性鉴定,通过免疫沉淀联合质谱、Uni-ZAP XR表达文库筛选鉴定抗原,借助免疫捕获的方法用抗体来分离复合物.结果:获得3株可稳定分泌抗人CPSI mAb的杂交瘤细胞系.mAb的Ig亚类(型)为IgGl(K),该mAb可用于ELISA检测、Western blot、免疫组化、免疫荧光染色、免疫沉淀实验和复合物的分离.结论:成功制备了抗人CPSI的mAb,为CPSI的研究提供了有力的工具.     

抗11β-羟类固醇脱氢酶1的单克隆抗体的制备与鉴定

目的:制备抗人11β-羟类固醇脱氢酶1(homo sapiens hydroxysteroid 11-beta dehydrogenase 1,HSD11B1)的单克隆抗体(mAb)并初步鉴定其特性.方法:将正常成人肝组织匀浆离心并分离线粒体,用线粒体总蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备mAb,并通过间接ELISA法、Western blot、免疫组化的方法对mAb进行特性鉴定,通过免疫沉淀、Uni-ZAP XR肝脏cDNA表达文库筛选鉴定抗原.结果:通过间接ELISA筛选获得1株可稳定分泌抗人HSD11B1 mAb的杂交瘤细胞系.其分泌的mAb的Ig亚类(型)为IgG1(κ),Western blot结果显示该mAb可以特异地识别相对分子质量(Mr)为35 000的蛋白;应用mAb CBF245对人肝脏cDNA表达文库(Uni-ZAP XR)进行筛选,阳性噬菌斑测序结果显示5个阳性克隆插入序列均为HSD11B1.结论:mAb BAD062特异地识别抗原HSD11B1,该mAb可用于ELISA检测、Western blot、免疫组化和免疫沉淀实验,为HSD11B1的研究提供了有力的工具.     

抗二羰基/L-木酮糖还原酶单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备抗人二羰基/L-木酮糖还原酶(Dicarbon-yl/L-xylulosereductase,DCXR)的单克隆抗体(mAb)并进行初步鉴定。方法将正常成人肝组织匀浆离心并分离线粒体,用线粒体总蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备mAb,并通过间接ELISA法、Westernblot及免疫组化的方法对mAb进行特性鉴定,通过免疫沉淀联合质谱、Uni-ZAPXR表达文库筛选鉴定抗原。结果获得1株可稳定分泌抗人DCXRmAb的杂交瘤细胞系。mAb的Ig亚类(型)为IgG1(κ),该mAb可用于ELISA检测、Westernblot、免疫组化和免疫沉淀实验。结论成功制备了抗人DCXR的mAb,为DCXR的研究提供了有力的工具。     

乙醛酸还原酶/羟基丙酮酸还原酶单克隆抗体的制备与鉴定

目的：制备鼠抗人乙醛酸还原酗羟基丙酮酸还原酶单克隆抗体（mAb）并进行初步鉴定。方法：将正常成人肝组织匀浆离心并分离出肝脏胞质总蛋白，用肝脏胞质总蛋白免疫BALB／c小鼠，采用杂交瘤技术制备mAb，并通过间接ELISA法、Western blot及免疫组化的方法对mAb进行特异性鉴定，通过免疫沉淀联合质谱和Uni-ZAP XR表达文库筛选鉴定抗原。结果：通过间接ELISA筛选获得杂交瘤细胞株ADB291，其分泌的mAb Ig亚类（型）为IgG1（κ），Western blot结果显示该mAb识别相对分子质量（Mr）为35000的蛋白；对免疫沉淀获得的相应抗原回收、酶切、质谱鉴定为GRH—PR。同时应用mAb ADB291对人肝脏cDNA表达文库（Uni-ZAP XR）进行筛选，筛选所获得的阳性噬菌斑测序结果显示2个阳性克隆插入序列均为GRHPR；阳性克隆转化表达后的Western blot结果确认该抗体识别肘，35000的表达蛋白。结论：mAb ADB291特异识别的抗原为GRHPR，该mAb在GRHPR的功能研究和二型原发性尿草酸盐过多遗传疾病的临床诊断等方面具有应用价值。     

抗肠出血性大肠杆菌O157:H7 EspA单克隆抗体的制备及其特性鉴定

目的:制备抗肠出血性大肠杆菌O157:H7EspA单克隆抗体(mAb)。方法:以重组EspA蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术并且联合间接ELISA筛选只针对EspA的杂交瘤细胞株。以Ig类与亚类鉴定试剂盒鉴定mAb的Ig亚类,ELISA、Western blot及免疫荧光技术鉴定抗体的免疫学特性。结果:获得3株稳定分泌抗EspA杂交瘤细胞的mAb,Ig亚型分别为IgG1κ型、IgG2aκ型、IgG2bκ型。Western blot和免疫荧光分析表明,3株杂交瘤细胞制备的mAb腹水都能特异地结合重组EspA蛋白和识别O157:H7的EspA成分。结论:成功地制备了抗肠出血性大肠杆菌O157:H7EspA的mAb,并证明了该mAb的生物学活性,为深入研究肠出血性大肠杆菌O157:H7的致病机制提供新的手段。     

抗人乳腺癌候选抑制蛋白1单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备抗人乳腺癌候选抑制蛋白1(BCSC-1)蛋白单克隆抗体(mAb),并对其特异性进行鉴定。方法:构建原核表达载体pET-30a-BCSC-1,在原核表达系统E.coliBL21(DE3)中表达重组人BCSC-1蛋白。超声洗涤纯化重组蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的脾细胞和同系小鼠的骨髓瘤细胞Sp2/0进行常规融合,通过有限稀释法进行克隆和间接ELISA筛选,获得分泌小鼠抗人BCSC-1蛋白mAb的杂交瘤细胞株,通过ELISA、Western blot等方法检测其特异性。将真核重组表达载体pcDNA3.1/v5-HisB-BCSC-1转染入乳腺癌MCF-7细胞,通过免疫组化确定了人BCSC-1蛋白的表达。结果:成功构建了原核表达载体pET-30a-BCSC-1,经IPTG诱导表达出了重组人BCSC-1蛋白,主要以包涵体的形式存在沉淀中。用纯化的重组BCSC-1蛋白免疫小鼠后经融合筛选得到1株稳定分泌抗BCSC-1的mAb杂交瘤细胞株。通过ELISA、Western blot、免疫组化等方法鉴定,抗BC-SC-1的mAb能与BCSC-1蛋白特异性结合。结论:成功制备了小鼠抗人BCSC-1的mAb。     

抗人Glypican3N端融合蛋白单克隆抗体研制及特性鉴定

目的:制备抗人磷脂酰蛋白聚糖3(Glypican3,GPC3)N端蛋白的单克隆抗体(mAb),并进行特性鉴定.方法:以纯化的GPC3 N端融合蛋白免疫BALB/c小鼠,应用淋巴细胞杂交瘤技术制备抗人GPC3N端mAb并进行纯化.经Western blot和ELISA方法鉴定其特异性、Ig亚类和效价.结果:获得2株可稳定...     

抗人分泌性白细胞蛋白酶抑制剂单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备抗人分泌性白细胞蛋白酶抑制剂(hSL-PI)单克隆抗体(mAb)。方法以hSLPI为免疫BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术制备抗hSLPI mAb。采用Ig类与亚类鉴定试剂盒鉴定mAb的Ig亚类;通过ELISA、Western blot、免疫组化染色法、流式细胞术、激光共聚焦显微镜技术鉴定mAb的特异性。结果获得4株可稳定分泌抗hSLPI mAb的杂交瘤细胞,其分泌的mAb均为IgM。Western blot分析表明,此株mAb所识别的靶分子的相对分子质量(Mr)约为12000。免疫组化染色表明,mAb与肺和结肠组织的上皮细胞、疑似肥大细胞、扁桃体和包皮组织的疑似肥大细胞的反应性均呈阳性。流式细胞术分析显示,4株mAb与人肺腺癌细胞系A549细胞中的SLPI均呈阳性反应。激光共聚焦扫描显微镜观察,荧光标记的阳性反应物主要位于A549细胞的胞质内。结论成功地制备抗hSLPI mAb,为变态反应性疾病和炎症性疾病的研究工作提供了有用的试剂。     

抗AGR2单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

目的:制备鼠抗AGR2单克隆抗体(mAb)并对其特性进行鉴定及其初步应用研究。方法:以AGR2-MBP融合蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备鼠抗AGR2的mAb,并用Protein-G亲和层析法纯化mAb。用间接ELISA法测定mAb的效价,以Western blot鉴定mAb的特异性。用免疫荧光、免疫沉淀和MTT法对mAb进行初步应用研究。结果:获得1株可持续、稳定分泌抗AGR2的mAb的杂交瘤细胞。杂交瘤细胞分泌的mAb的Ig亚类(型)为IgG1(κ),腹水mAb的效价达1×10-6。Western blot检测显示,在Mr为20000处有1条清晰的带。免疫荧光显示,该mAb可与乳腺癌细胞中的AGR2蛋白结合。免疫沉淀证实该mAb可与天然状态的AGR2有效结合。MTT实验显示该mAb对乳腺癌细胞MCF7的生长有抑制作用。结论:制备出的鼠抗AGR2的mAb效价高、特异性良好,可抑制细胞的生长,有一定的应用价值,为进一步研究AGR2的功能及其在乳腺癌、前列腺癌等癌症的诊断和治疗中的作用提供了工具。     

抗人肺鳞癌单克隆抗体的制备及其特性鉴定

目的:制备和鉴定抗人肺鳞癌单克隆抗体(mAb),为肺癌的早期诊断和靶向治疗提供候选抗体药物及为肺癌抗原的筛选提供工具。方法:用肺癌细胞株YTMLC-90做抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0融合,间接ELISA和有限稀释法筛选抗体阳性的杂交瘤细胞获得mAb。染色体计数法鉴定杂交瘤细胞,并进行mAb同种型鉴定;对细胞培养上清液和腹水中的mAb采用间接ELISA法进行初步特异性检测及效价测定;采用Western blot法鉴定其与不同组织抗原结合活性;采用免疫组化染色法鉴定其在肺癌组织中的分布。结果:筛选出5株可稳定分泌抗肺鳞癌mAb的杂交瘤细胞株E2、F9、E11、D5和C6,分泌的抗体均为IgG1亚类,κ亚型。C6染色体数目为89～112条,细胞培养上清和腹水效价分别为1∶1 004和1∶104,ELSA和Western blot结果显示其能特异性与肺癌细胞结合,未见与其他高发癌组织和正常组织结合。结论:成功地制备了能够特异识别肺癌组织的mAb。     

人核迁移蛋白单克隆抗体的制备及其在人巨核细胞中的表达

目的: 制备人核迁移蛋白(hNudC )的单克隆抗体(mAb)并鉴定其特性.方法: 从人胎肝组织中克隆得到 hNudC 基因, 构建重组表达质粒 pET-28b/hNudC, 表达带有6-His标记的重组hNudC, 用纯化的重组 hNudC 蛋白免疫 BALB/c小鼠制备mAb, 用ELISA筛选抗体阳性的细胞克隆, 用免疫荧光染色法及Western blot 试验鉴定 mAb 的特异性.结果: 获得2株杂交瘤细胞系2C16和2D8, 其分泌的mAb的 Ig亚类(型)分别为IgG1 和IgM(ê) , 杂交瘤细胞培养上清的ELISA效价分别为1∶ 64和1∶ 32; 腹水mAb的效价分别为1∶ 1×105和1∶ 5×104.mAb与重组hNudC蛋白有较强的特异性反应, 免疫荧光染色和Western blot试验证明, 制备的 mAb 可以识别人巨核系白血病细胞株 Dami、 Meg-01和人脐带血来源的CD41 巨核细胞中表达的 hNudC 蛋白.结论: 成功地制备了特异性抗 hNudC mAb, 为研究 hNudC 蛋白的功能、天然分布及异常表达奠定了基础.     

抗人DcR3单克隆抗体的研制及其鉴定

目的:制备抗人DcR3单克隆抗体(mAb),并鉴定其特异性.方法:纯化的His-DcR3融合蛋白免疫小鼠,应用淋巴细胞杂交瘤技术制备抗人DcR3 mAb并进行纯化,纯化后的抗体经Western blot和ELISA方法鉴定其特异性、Ig亚型和效价.结果:获得5株稳定分泌抗DcR3 mAb的杂交瘤细胞,均属IgG1亚型,其腹水抗体效价为1×10-5 ～1×10-7,Western blot显示5株细胞分泌的mAb均可识别DcR3蛋白,其中1株(1B1)可与SW480细胞成分反应.结论:成功建立稳定分泌抗人DcR3 mAb的杂交瘤细胞株,其分泌的抗体特异性强、效价高,为研究DcR3在组织中的表达、分布及研制ELISA试剂盒奠定基础.     

Clusterin抗原的表达、抗体制备及其初步鉴定

目的:制备Clusterin(CLU)多克隆和单克隆抗体(mAb),并进行特性鉴定.方法:以成人肝cDNA表达文库为模板,构建重组表达质粒pGEX-4T-1-CLU和PET-32a-CLU.GST-CLU融合蛋白在大肠杆菌中表达,被作为免疫原制备兔多抗和鼠mAb.采用ELISA法和Western blot鉴定抗CLU抗血清在重组蛋白和天然蛋白中的特异性.采用Western blot,间接免疫荧光,免疫组化鉴定mAb的特异性.结果:GST-CLU融合蛋白在相对分子质量(Mr)约54 000处呈现明显表达条带.Western blot鉴定表明,制备的抗CLU兔多克隆抗体可特异地识别成人肝总蛋白中Mr约52 000和58 000的CLU蛋白.获得9株可稳定分泌抗CLU的杂交瘤细胞株可识别重组人CLU蛋白,其中有2株可特异性结合HepG2细胞质中的蛋白,4株可特异性结合成人肝脏组织肝细胞质中的蛋白.结论:成功地制备出兔抗人CLU抗血清和9株抗CLU的mAb,为进一步研究CLU在肿瘤中的功能奠定了实验基础.     

抑制和激活蛋白1(Rap1)单克隆抗体的制备和鉴定

目的制备并鉴定人端粒相关蛋白抑制和激活蛋白1(Rap1)的单克隆抗体。方法用重组原核人Rap1蛋白免疫BALB/c小鼠;细胞融合后,间接ELISA筛选阳性杂交瘤,建立分泌抗人Rap1蛋白单克隆抗体(m Ab)的杂交瘤细胞株,并进行效价测定和特异性鉴定。结果制备并获得1株稳定分泌抗人Rap1蛋白m Ab的杂交瘤细胞株。ELISA测定腹水效价高达1∶10 000以上。Western blot法、免疫沉淀和免疫荧光染色证实该m Ab能特异性识别人Rap1蛋白并可用于上述不同检测。结论成功制备获得了亲和力高、特异性好的抗人端粒相关蛋白Rap1的m Ab。     

抗人ILT-4单克隆抗体制备及初步鉴定

目的: 制备抗人ILT4分子单克隆抗体(mAb)并进行初步鉴定.方法: 应用淋巴细胞杂交瘤技术, 制备小鼠源性抗人ILT4 mAb.用间接ELISA法测定腹水mAb的效价.以Western blot测定mAb的抗原结合活性.通过流式细胞术(FCM)对mAb结合转染细胞表面及天然细胞表面ILT4分子的活性进行鉴定.结果: 获得7株分泌抗ILT4 mAb的杂交瘤细胞株.ELISA法测定腹水mAb的效价均达1×10-6, 7株mAb均为IgG1(κ).Western blot结果显示, 3株mAb与人ILT4有良好的结合活性.用转染细胞及U937细胞做FCM分析发现另外4株mAb可结合真核表达的及天然的ILT4分子.结论: 获得7株能特异性识别ILT4分子的mAb, 为研究ILT4分子的组织分布和功能研究提供了可靠的实验手段.     

抗果蝇ECP蛋白单克隆抗体的制备及特性鉴定

目的:制备抗果蝇ECP蛋白的单克隆抗体(mAb)并进行特性鉴定。方法:用大肠杆菌表达并纯化的GST-ECP融合蛋白,免疫6~8wk的雌性BALB/c小鼠,取其脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞融合,经间接ELISA筛选和克隆化培养制备杂交瘤细胞系。用间接ELISA及Western blot等方法对mAb的Ig亚类(型)、腹水效价及特异性进行鉴定。结果:获得1株杂交瘤细胞株,命名为8G9。Ig亚类(型)鉴定表明,此株mAb为IgG1(κ型)。腹水mAb的效价为1∶1×105。Western blot分析表明,该株mAb可与果蝇的幼虫、蛹及成虫组织中表达的ECP特异性结合,可特异性的识别ECP抗原的231~300aa区段。结论:获得1株能稳定分泌抗ECP mAb的细胞株,为进一步研究ECP的功能奠定了基础。     

抗人层黏连蛋白单克隆抗体的制备及特性鉴定

目的:制备抗人层黏连蛋白(laminin,LN)单克隆抗体(mAb)并鉴定其特性。方法:以人LN免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗人的mAb;同时采用间接ELISA法柃测mAb的腹水效价及mAb的相对亲和力;采用ELISA法鉴定mAb的Ig亚类、进行表位分析及特异性鉴定。结果:获得4株可分泌特异性mAb的杂交瘤细胞2A3、2C6、3G7和4H2,其腹水mAb 的效价为3.6 × 104～2.1×106;4株mAb的Ig亚类为IgG1,轻链均属κ型;相对亲和力2C6在1012以上,2A3、3G7和4H2在106以上;其中2株与1个表位结合,另2株与另外的1个表位结合。结论:成功地制备出抗人LN的mAb,为进一步研究LN在一些疾病中的作用提供了工具。     

抗鸡白细胞介素4单克隆抗体的制备及其鉴定北大核心CSCD

目的制备抗鸡白细胞介素4(ChIL-4)单克隆抗体(mAb)并进行鉴定。方法以重组鸡IL-4(GST-ChIL-4)作为免疫原免疫8周龄BALB/c小鼠,以重组蛋白His-ChIL-4作为检测抗原建立筛选阳性杂交瘤细胞株的间接ELISA;以有限稀释法制备稳定分泌抗ChIL-4 mAb细胞株;采用间接ELISA、间接免疫荧光法(IFA)以及Western blot法分析mAb的特异性。结果获得4株抗ChIL-4的mAb,分别命名为6A8、18F12、19F1、20G3,腹水mAb的ELISA效价为(1.6~6.4)×104;ELISA、IFA及Western blot结果显示该4株mAb均是特异针对重组ChIL-4的mAb,不具有识别重组牛IL-4、鸡γ干扰素(IFN-γ)等其他蛋白的能力。结论成功制备了抗ChIL-4的mAb。     

具有中和活性抗人类腺病毒单克隆抗体的制备、鉴定及应用

目的:制备具有中和活性抗人类腺病毒(HAdv)单克隆抗体(mAb),并进行鉴定与应用.方法:以活的人类腺病毒3型(HAdv-3)滴鼻免疫BALB/c鼠,用细胞融合技术制备抗HAdv 的mAb细胞株,采用中期分裂相秋水仙素阻抑法对mAb细胞株染色体进行分析;使用鼠mAb亚型鉴定试剂盒进行抗体亚型鉴定,通过ELISA、Western blot和间接免疫荧光技术进行特异性鉴定.建立HAdv-3感染动物模型,用获得的HAdv-3 mAb进行保护性研究.结果:细胞融合率为86%,抗HAdv抗体阳性孔率为51.4%.鉴定1株杂交瘤细胞(1A4),染色体数为98条,抗体亚类属IgG2a/κ,抗体腹水ELISA效价达10~(-5).ELISA、Western blot和间接免疫荧光证实该mAb特异性好.该mAb对HAdv-3感染动物有保护性作用.结论:成功地制备具有中和活性的抗HAdv mAb.该mAb识别的是HAdv六邻体蛋白,对HAdv-3感染动物有保护作用.