结核分枝杆菌分泌蛋白MPT51在原核表达载体中的克隆、表达、纯化与鉴定

目的对结核分枝杆菌的一种分泌蛋白MPT51的基因进行克隆,表达,纯化与鉴定,为核酸疫苗的研制与应用打下基础。方法以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,用PCR法对编码MPT51蛋白的抗原基因进行扩增,产物克隆到表达载体pET22b中,构建了含mpt51的重组质粒,将此重组质粒先转化到E.coliXLI-Blue内提取质粒,酶切及测序鉴定,再转化入E.coliBL21(DE3)PLysS菌株内,以IPTG进行诱导后,破菌,离心,包涵体经尿素变性溶解后用His·Bind亲和层析柱纯化,透析复性,纯化后蛋白进行SDS-PAGE,通过电转移将胶中蛋白转到硝酸纤维素薄膜上后进行特异性免疫检测。结果电泳发现转化了重组质粒的菌株有蛋白表达,所表达的蛋白质相对分子质量为27800,抗体检测有特异条带,大小为27.8kDa。结论目的基因克隆到了表达载体内并证明表达,重组结核杆菌分泌蛋白MPT51的成功表达为核酸疫苗的研制与应用和免疫效应检测以及上述抗原、抗体的大规模制备打下基础。     

结核分枝杆菌热休克蛋白Hsp70在原核表达载体中的克隆表达与鉴定

目的对结核分枝杆菌的一种热休克蛋白Hsp70基因进行克隆,鉴定,并在原核系统中表达。方法以结核杆菌H37Rv菌株基因组DNA为模板,用PCR法对基因Hsp70进行扩增,产物与载体质粒pET-22b(+)构建表达Hsp70的重组质粒,将此重组质粒先转化到E.coliDH5α内提取质粒,酶切鉴定,再转化入表达宿主E.coliBL21(DE3)PlysS菌株内,对转化菌株以IPTG进行诱导后,破菌,离心,上清进行SDS-PAGE,通过电转移将胶中蛋白转到硝酸纤维素薄膜上后进行免疫印迹分析。结果电泳发现转化了重组质粒的菌株有表达蛋白,所表达的蛋白质相对分子质量为70 000,抗体检测有特异带大小为70kDa。结论成功进行了结核杆菌分泌热休克蛋白Hsp70基因的克隆表达。     

结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64的克隆表达和纯化

目的构建结核分枝杆菌分泌蛋白MPT64原核表达载体并进行表达和纯化。方法以结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA为模板扩增出MPT64基因,产物经纯化回收后与载体pMD-T连接转化,酶切鉴定,克隆到pET21a原核表达载体,测序鉴定插入序列完全正确者转化大肠杆菌BL21,诱导表达MPT64融合蛋白,利用亲和层析纯化表达产物,SDS-PAGE电泳进行鉴定。结果成功构建MPT64表达载体,SDS-PAGE电泳鉴定成功表达MPT64蛋白。并以此蛋白进行结核抗体的检测,其特异性和敏感性分别为96%和43%。结论成功表达结核分枝杆菌MPT64蛋白,并进行特异性和敏感性的检测,证明重组的MPT64蛋白有希望成为结核病血清学诊断的组合抗原的候选者之一。     

结核分枝杆菌分泌蛋白MPT53基因的克隆、表达和纯化

目的构建结核杆菌分泌蛋白MPT53原核表达载体并进行表达和纯化。方法以结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组DNA为模板扩增MPT53基因，产物经纯化回收后与载体pMD-T连接转化，酶切鉴定，克隆到pET32a原核表达载体，测序鉴定插入序列完全正确者转化大肠埃希菌BL21，诱导表达MPT53融合蛋白，亲和层析纯化后，进行SDS-PAGE电泳鉴定。结果成功构建PET32a-MPT53重组质粒，转化BL21后经IPGT诱导成功表达分子质量单位为36ku的MPT53蛋白，与理论值相符。结论成功表达结核分枝杆菌MPT53蛋白，为其应用打下了基础。     

结核分枝杆菌毒力分泌系统Rv3871基因的分子克隆及蛋白表达研究

目的为探索参与结核分枝杆菌(MTB)毒力分泌系统相关基因的分子功能,对MTB H37Rv株编码Rv3871蛋白基因进行克隆、表达及鉴定分析。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,用PCR扩增Rv3871基因片段,并重组到原核表达载体pET32a( )中,转化E.coliBL21(DE3)菌株,用IPTG诱导蛋白表达,通过SDS-PAGE和Western blot对目的蛋白进行检测分析。结果阳性重组质粒经BamHⅠ和XhoⅠ双酶切得到1 776和5 900 bp两条片段,与预期大小一致。重组质粒测序,与NCBI上Rv3871编码序列比对完全一致,且输入片段读码框与表达载体读码框相吻合。SDS-PAGE检测表达蛋白分子质量单位为84 ku;Western blot检测出特异性阳性信号。结论本研究成功构建了结核杆菌毒力分泌系统重要相关基因Rv3871的原核表达质粒,并在大肠埃希菌中表达Rv3871蛋白,为进一步探讨该基因在MTB毒力分泌中的功能奠定了基础。     

结核分枝杆菌14000抗原基因的克隆、表达纯化及抗原性分析

目的对结核分枝杆菌14 000抗原基因进行克隆表达及纯化,并评价其抗原性。方法以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板,用PCR方法获得目的基因构建大肠杆菌高效表达株;亲和层析柱纯化重组蛋白;进SDS-PAGE电泳鉴定;通用ELISA法进行重组蛋白的抗原性检测分析。结果获得了结核分枝杆菌抗原14 kD基因,在大肠杆菌BL21中高效表达,Western印迹结果证实该重组蛋白能与抗结核分枝杆菌多克隆抗体发生特异免疫结合反应。ELISA分析中,该纯化的重组抗原敏感性、特异性和准确性分别为:52.5%、96.7%和67.2%,具有良好的抗原性和较高的特异性。结论14 kD重组蛋白抗原具备良好的抗原性与特异性,为结核病诊断、重组疫苗应用和免疫效应检测以及抗原、抗体的大规模制备打下基础。     

结核分枝杆菌NrdF1、PE_PGRS35、Rv1985c和Rv1986的原核表达及检测牛结核病抗体之应用

目的 在大肠杆菌中表达结核分枝杆菌RD2区域的NrdF1、PE_PGRS35、Rv1985c和Rv1986蛋白,并评价诊断牛结核病中的应用潜能。方法 以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为模板,PCR 扩增nrdF1,pe_pgrs35,rv1985c 和 rv1986基因,并将其克隆到表达载体中,重组表达质粒转化E.coli BL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白表达,镍柱亲和纯化重组蛋白,SDS-PAGE和Western blotting试验鉴定目的蛋白的表达及其反应原性。以纯化的重组蛋白作为包被抗原,通过ELISA方法测定牛血清中特异性抗体,以之评价这些蛋白用于牛结核病抗体检测的价值。结果 成功表达了NrdF1、PE_PGRS35、Rv1985c和Rv1986蛋白,相对分子质量为42 ku、63 ku、46 ku和41 ku,对表达产物进行镍柱亲和纯化,获得了纯度较高的融合蛋白。重组蛋白均能与抗HIS单抗发生特异反应,表现出良好的反应原性。通过间接ELISA方法检测牛血清中特异性抗体,阳性检出率分别为7.35%、22.06%、16.18% 和16.18%。结论 结核分枝杆菌原核表达的NrdF1、PE_PGRS35、Rv1985c和Rv1986蛋白具有用作牛结核病血清学诊断试剂的潜能。     

结核分枝杆菌复苏因子Rv2450c基因的克隆、表达和纯化

目的对结核分枝杆菌复苏因子Rv2450c基因克隆、并测序正确后进行融合蛋白表达、纯化。方法通过PCR扩增结核分枝杆菌H37Rv复苏因子Rv2450c基因,酶切,克隆至PGEM-TEasy质粒,测序确定插入片段的正确性,再克隆至表达载体pET30a中,并转化至BL21（DE3）中。经PCR鉴定阳性的菌液通过IPTG诱导,表达氨基端带6个连续组氨酸残基的Rv2450c蛋白,并纯化。结果获得了结核分枝杆菌复苏因子Rv2450c基因,构建了重组表达质粒,得到融合了6个连续组氨酸残基的Rv2450c蛋白,纯度〉90%。结论应用基因重组表达技术表达结核杆菌复苏因子蛋白,可为下一步摸索临床标本结核分枝杆菌复苏培养及复苏基因的功能研究打下一个良好的基础。     

结核分枝杆菌复苏因子Rv2450c基因的克隆、表达和纯化

目的对结核分枝杆菌复苏因子Rv2450c基因克隆、并测序正确后进行融合蛋白表达、纯化。方法通过PCR扩增结核分枝杆菌H37Rv复苏因子Rv2450c基因，酶切，克隆至PGEM—TEasy质粒，测序确定插入片段的正确性．再克隆至表达载体pET30a中，并转化至BL21（DE3）中。经PCR鉴定阳性的菌液通过IPTG诱导，表达氨基端带6个连续组氨酸残基的Rv2450c蛋白，并纯化。结果获得了结核分枝杆菌复苏因子Rv2450c基因，构建了重组表达质粒，得到融合了6个连续组氨酸残基的Rv2450c蛋白，纯度〉90％。结论应用基因重组表达技术表达结核杆菌复苏因子蛋白，可为下一步摸索临床标本结核分枝杆菌复苏培养及复苏基因的功能研究打下一个良好的基础．     

结核分枝杆菌Rv1246c和Rv1247c基因的重组质粒构建及蛋白表达

目的应用生物信息学方法分析结核分枝杆菌的Rv1246c和Rv1247c所编码蛋白的结构特征,并对其进行克隆和表达。方法利用Bioedit、Dnaman及Pfam等对Rv1246c和Rv1247c所表达蛋白结构进行分析;以结核分枝杆菌H37Rv的基因组为模板,用PCR分别扩增Rv1246c和Rv1247c基因片段,并重组到原核表达载体pET32a( )中,转化E.coliBL21(DH3)菌株,用IPTG诱导蛋白表达。通过SDS-PAGE及Western-blot免疫印迹法检测目的蛋白的表达情况。用纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,间接ELISA检测抗体效价。结果生物信息学分析表明它们与大肠杆菌的relBE家族有相似的蛋白模块,Rv1246c蛋白与大肠杆菌RelE同源性是21.55%,Rv1247c同源性是23.85%;两个重组质粒构建成功;通过SDS-PAGE检测分别在31kD和29kD处有特异性条带;Western-blot免疫印迹出现特异性阳性信号;间接ELISA检测多克隆抗体效价均大于1:40 000。结论本研究首次成功构建了结核分枝杆菌的Rv1246c和Rv1247c的原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达了Rv1246c和Rv1247c蛋白,为进一步研究该组基因的分子功能奠定了良好基础。     

结核分枝杆菌组合蛋白的表达及血清学诊断价值的评价

目的取得能用于结核病血清学诊断的敏感性、高特异性强的组合蛋白。方法用DNA双链全合成的方法合成ESAT6,MPT64,38KD,Ag85B等结核分枝杆菌特异性抗原的抗原表位基因,用PCR法将这些基因片段连接起来成为新型抗原的编码基因。将该编码基因克隆于pET24b载体,经测序鉴定后转化于大肠杆菌BL21菌株用IPTG进行诱导表达。组合蛋白经镍柱纯化后用Western印迹法和酶联免疫实验（ELISA）对其抗原性和特异性进行检测。结果携带重组质粒的菌株经IPTG诱导后以包涵体的形式大量表达组合蛋白,经镍柱纯化后蛋白质浓度达到0．5mg／ml,western实验表明：该组合蛋白能与结核病人血清特异性结合,而不与健康人血清结合。以该组合蛋白为包被抗原采用ELISA法检测结核抗体的灵敏度为61％,特异性为97．3％。PPD检测的灵敏度和特异性分别为73．7％和91．8％。该组合蛋白检测卡介苗接种阳转血清的阳性率为2．1％,特异性为97．9％,而PPD检测卡介苗接种阳转血清的阳性率为22．3％,特异性为79．7％。结论该组合蛋白用于结核病血清学诊断具有较高的灵敏度和特异性,能够为结核病的临床诊断提供一定的指导。     

弓形虫表面抗原SAG2基因的克隆表达纯化及鉴定

目的构建弓形虫表面抗原2(SAG2)基因重组质粒并在大肠埃希菌中表达。方法根据SAG2基因序列设计并合成引物,用PCR法从弓形虫基因组DNA中扩增SAG2基因片段,再克隆到p GEX-4T载体中,构建重组质粒。重组质粒经酶切鉴定并测序后,在大肠埃希菌BL21中诱导表达,产物经SDS-PAGE分析并纯化,以Western blotting分析其反应原性。结果 SAG2基因PCR产物大小约为561 bp,与预期相符。重组质粒经酶切及PCR鉴定构建成功,测序结果与已知序列吻合。重组质粒转化菌经IPTG诱导后表达的SAG2融合蛋白分子量约为47 ku,该蛋白可被GST标签抗体识别。结论成功重组了弓形虫SAG2基因,表达蛋白具有反应原性。     

华支睾吸虫成虫RPEF基因的克隆和表达

目的　构建华支睾吸虫成虫RNA聚合酶Ⅱ延长因子 (RPEF)基因重组质粒 ,分析其编码序列 ,并进行大肠杆菌原核重组表达和免疫鉴定。方法　根据RPEF基因已知序列设计一对引物 ,用常规PCR技术从华支睾吸虫质粒文库模板中扩增RPEF基因片段 ;将目的基因PCR产物和空质粒 pGEX 4T 1同时用BamHⅠ和SalⅠ限制性内切酶双酶切 ,纯化回收后建立连接反应并转化大肠杆菌BL2 1。将构建的重组质粒pGEX 4T 1 RPEF双酶切、PCR、测序鉴定正确后在BL2 1中诱导表达 ,SDS PAGE电泳和Western blot方法鉴定其原核表达效果。结果　成功构建出RPEF基因原核重组质粒 pGEX 4T 1 RPEF。SDS PAGE分析显示RPEF基因在大肠杆菌BL2 1系统中得以高效表达 ,其融合蛋白分子量大约 4 5kD ,与理论值相符。Western blot的结果显示此RPEF融合蛋白可被山羊GST单抗所识别 ,融合蛋白具有GST免疫反应性。结论　筛选到华支睾吸虫RNA聚合酶Ⅱ延长因子 (RPEF)基因 ,并成功构建原核表达载体及在E .coliBL2 1系统中高效表达。     

华支睾吸虫3-磷酸甘油酸激酶基因的扩增、克隆及表达

目的　构建编码华支睾吸虫3磷酸甘油酸激酶基因的原核表达载体,并分析其在大肠埃希菌中的表达。　方法　用Trizol法从华支睾吸虫 3成虫体内提取总RNA,并将其反转录成cDNA。根据华支睾吸虫磷酸甘油酸激酶的已知基因,利用DNAclub和PCRdesign软件设计合成一对特异引物 ,从合成的cDNA中,用PCR技术扩增出目的片段。将目的片段和原核表达载体同时双酶切后连接,重组体转入JM109大肠埃希菌,用双酶切、PCR和测序筛选阳性克隆。挑选1个阳性菌落,用异丙基βD硫代半乳糖苷诱导表达,表达产物进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)鉴定。　结果　用逆转录聚合酶链反应技术扩增出1条1248bp大小的片段,PCR产物测序鉴定正确;转化后得到10个克隆,双酶切、PCR扩增鉴定,其中6个为阳性克隆;表达产物用SDS PAGE鉴定,在相对分子质量70000处有1条与理论预测的融合蛋白大小相一致的特异条带。　结论　成功构建重组原核表达载体pGEX4T1PGK,所表达的蛋白为含有谷胱甘肽的融合蛋白     

结核分枝杆菌Rv1009基因蛋白的克隆和表达

目的克隆表达结核分枝杆菌促Rv1009基因,序列测定正确后进行融合、表达。方法采用热启动聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)从结核分枝杆菌H37Rv基因组中扩增出Rv1009编码基因,用限制性内切酶消化后插入pGEX 4T-2载体中,将重组质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3),目的基因经IPTG诱导,表达Rv1009基因蛋白。结果经PCR扩增在1300bp处发现一条目的片段,获得了结核分枝杆菌H37Rv株Rv1009基因蛋白,经诱导后高效表达分子量为64KD的外源蛋白,与预期分子量大小一致,凝胶自动扫描分析,在A600值为0．6,IPTG终浓度为0．3 mmol／L,诱导表达3 h时融合蛋白表达量即达峰值,占菌体总蛋白的22．8％。结论构建了结核分枝杆菌Rv1009基因重组表达载体,获得了RPF样融合蛋白的高效表达,为今后深入研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌潜伏感染相关蛋白ICL的表达及鉴定

目的　表达结核分枝杆菌潜伏感染相关蛋白ICL ,鉴定其生物学活性并制备其多克隆抗体。方法　采用PCR法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出icl基因片段 ,将其插入原核表达质粒pQE30 ,构建重组质粒 pQE30 icl。将pQE30 icl转化大肠杆菌 ,用IPTG诱导目的基因表达。Western blot免疫印迹法鉴定后纯化该表达产物 ,测定其酶活性并用此纯化蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体。结果　序列分析发现PCR扩得的icl有两个核苷酸突变 ,但均为无义突变。在大肠杆菌中表达的目的产物经SDS PAGE分析约为 4 7kDa。免疫印迹分析证实目的蛋白与阳性结核病患者抗血清产生特异性反应。纯化的目的蛋白异柠檬酸裂解酶的酶活性为 16 .7u/mg。双向免疫扩散法测定目的蛋白免疫兔血清的抗体效价为 1 32。结论　研制出的结核分枝杆菌重组ICL具有异柠檬酸裂解酶活性和抗原性 ,重组ICL和抗ICL免疫血清的制备为抗结核分枝杆菌潜伏感染的研究奠定了必要的物质基础。     

恙虫病东方体Gilliam株56kDa蛋白部分基因的原核表达及初步鉴定

目的　对恙虫病东方体Gilliam株 5 6kDa蛋白部分基因进行原核表达 ,以获得高效表达、有生物活性目的蛋白 ,为恙虫病诊断试剂的研制打下基础。方法　根据Gilliam株东方体 5 6kDa蛋白基因序列设计特定引物 ,用PCR法扩增出编码5 6kDa抗原富含亲水区及同源性高的C端一段长约 70 0bp的DNA ,插入原核载体PGEX - 4T - 2 ,转化大肠杆菌TGI ,抽提质粒 ,酶切鉴定 ,含插入片段的重组质粒进行序列分析 ,再转化表达宿主菌大肠杆菌BL2 1(DE3) ,IPTG诱导表达 ,用SDS -PAGE及Western -blot进行分析鉴定。结果　SDS -PAGE检测表明该截短片段以融合蛋白的方式得到成功表达 ,在相对分子量 5 8kDa处有表达条带 ,经薄层扫描分析 ,目的蛋白条带占全菌蛋白的 30 5 %。Western -blot证实该融合蛋白能被恙虫病患者阳性血清识别。结论　表达产物初步鉴定具有生物活性 ,有望应用于恙虫病诊断试剂的研制     

弓形虫GRA6抗原基因的克隆与表达

目的在大肠杆菌中高效表达弓形虫抗原GRA6。方法采用聚合酶链反应(PCR)从弓形虫昆山分离株和RH株总DNA中分别扩增到编码GRA6的基因，经DNA序列分析后导入表达载体。PGEX-5X-3。然后在大肠杆菌BL21-Codon Plus(DE3)-RP中进行表达，以SDS-PAGE和Westen blotting进行鉴定，用GST亲和层析柱纯化表达产物。结果1．在我们所比较的336个碱基中，弓形虫昆山分离株与RH株之间碱基基本一致。2．得到一分子量为49kDa的融合蛋白。占大肠杆菌总蛋白的25．55％，通过Westen blotting证实，该重组抗原能被弓形虫感染的人特异性IgM和IgG血清所识别。结论1．弓形虫昆山分离株和RH株的GRA6基因片段几乎完全一致；2．在大肠杆菌中得到了高效表达的融合蛋白；3．该重组抗原能被弓形虫感染的人特异性IgM和IgG血清所别．可用于构建具有高度敏感性和特异性的弓形虫病检测试剂盒．     

结核分枝杆菌CFP-10与Rv2626c蛋白的表达及血清学诊断研究

目的　通过构建结核分枝杆菌（结核菌）CFP-10和Rv2626c蛋白表达载体,并在大肠杆菌表达,对其免疫反应性进行鉴定评价。方法　用PCR法从结核菌H37Rv基因组DNA分别扩增出CFP-10、Rv2626c基因,连接到表达载体PET30a上, 在大肠杆菌中表达;组氨酸标签(His - Tag) 镍柱层析纯化重组蛋白;用ELISA方法进行检测。结果　构建了含CFP10、Rv2626c重组质粒的大肠杆菌工程菌, 发现目的蛋白主要以可溶形式存在;用重组CFP10、Rv2626c蛋白组成联合抗原, ELISA方法检测214份血清, 阳性率达77.1%。结论　目的基因克隆入宿主菌中并表达成功, 重组的CFP-10、Rv2626c蛋白组成联合抗原可能成为结核病血清学诊断的组合抗原之一。