抑癌基因PTEN对人结肠癌LoVo细胞生长的影响

目的探讨PTEN基因转染对结肠癌LoVo细胞的抑制作用.方法将人野生型及突变型PTEN cDNA通过脂质体导入结肠癌细胞LoVo中,并用RT-PCR、流式细胞术检测细胞的PTEN mRNA和蛋白质表达.用流式细胞仪和MTT法分析5-Fu对转染前后LoVo细胞抑制周期和诱导凋亡的能力.结果转染野生型PTEN基因可明显增强结肠癌LoVo细胞的PTEN表达,5-Fu对转染后的LoVo细胞抑制细胞周期和诱导凋亡的作用明显增强.突变型在结肠癌细胞LoVo中有表达但无明显抑制作用.结论转染的PTEN基因可显著上调结肠癌LoVo细胞的PTEN表达,促进细胞凋亡;联合应用PTEN基因转染和5-Fu可获得协同的细胞毒作用.     

抑癌基因PTEN对人结肠癌LoVo细胞生长的影响

目的:探讨PTEN基因转染对结肠癌LoVo细胞的抑制作用。方法:将人野生型及突变型PTENcDNA通过脂质体导入结肠癌细胞LoVo中,并用RT-PCR、流式细胞术检测细胞的PTENmRNA和蛋白质表达。用流式细胞仪和MTT法分析5-Fu对转染前后LoVo细胞抑制周期和诱导凋亡的能力。结果:转染野生型PTEN基因可明显增强结肠癌LoVo细胞的PTEN表达,5-Fu对转染后的LoVo细胞抑制细胞周期和诱导凋亡的作用明显增强。突变型在结肠癌细胞LoVo中有表达但无明显抑制作用。结论:转染的PTEN基因可显著上调结肠癌LoVo细胞的PTEN表达,促进细胞凋亡;联合应用PTEN基因转染和5-Fu可获得协同的细胞毒作用。     

稳定表达野生型和突变型DNA聚合酶β的NIH3 T3细胞系的建立及其生长特性

目的：建立稳定表达野生型及突变型DNA聚合酶β（polβ）的NIH3T3细胞系。方法：用脂质体转染法分别将野生型和突变型polβ真核表达载体pcDNA3．1-PW和pcDNA3．1-PM3转染入NIH3T3细胞,经G418筛选得到稳定转染细胞系。用RT—PCR、免疫印迹法检测转染细胞polβmRNA和POLB蛋白的表达水平．MTT法测转染细胞生长曲线,免疫组化法测增殖细胞核抗原（PCNA）,并用流式细胞仪测细胞周期。结果与结论：成功建立了稳定表达野生型及突变型polβ的NIH3T3细胞系。野生型polβ对NIH3T3细胞生长无明显影响,突变型polβ则使NIH3T3细胞生长速度加快,细胞周期发生改变,细胞多被阻滞在S期。     

电离辐射诱导pEgr-hPTEN 表达增强其体外抗肿瘤作用

目的：研究辐射诱导表达载体pEgr-hPTEN体外稳定转染联合X射线照射对恶性胶质瘤细胞SHG-44增殖和诱导细胞凋亡的作用。 方法：以脂质体介导携有外源野生型PTEN基因的表达载体pEgr-hPTEN转染人胶质瘤SHG-44细胞,筛选稳定转染细胞克隆并扩增培养,以Western blotting法检测PTEN基因的辐射诱导表达情况,应用流式细胞仪及生长曲线测定稳定转染联合0~10 Gy X射线照射对胶质瘤细胞增殖、凋亡的影响。 结果：SHG-44-hPTEN稳定转染细胞PTEN蛋白的相对表达量可被辐射诱导增强,5 Gy以内呈剂量依赖性增加。稳定转染联合辐射可明显抑制肿瘤细胞的恶性增殖并诱导肿瘤细胞凋亡,照射后第8天稳定转染不同剂量组细胞数仅为稳定转染0 Gy假照组的30.0%~50.0%和未转染0 Gy假照组的7.7%~13.0%;稳定转染不同剂量照射组早期凋亡细胞百分数分别为稳定转染0 Gy假照组的1.5~2.3倍、未转染照射组的1.9~4.4倍及未转染0 Gy假照组的3.4~5.1倍。 结论：体外基因-放射联合作用可诱导肿瘤细胞凋亡明显增多,具有显著的肿瘤抑制作用。     

突变型PUMA(S10A)对Hela细胞的凋亡作用及其分子机制

目的 观察突变型PUMA和野生型PUMA对Hela细胞在促凋亡及抑制肿瘤细胞增殖方面的生物学功能差异,并探讨导致这些差异的分子机制.方法 实验随机分为:空载体质粒组、野生型PUMA组、突变型PUMA 3个实验组,应用脂质体转染方法分别将空载质粒、野生型PUMA质粒、突变型PUMA质粒转染Hela细胞中,转染24、48 h后用实时定量PCR和Western blot法检测各组PUMA表达情况;野生型实验组和突变型实验组分别加入蛋白质合成抑制剂放线菌酮后,Western blot法检测PUMA蛋白的表达;MTT及流式细胞术检测野生型PUMA与突变型PUMA对细胞增殖抑制和促凋亡作用.结果 在相同转染效率的情况下,通过Western blot法分析野生型PUMA组和突变型PUMA组的表达水平,结果表明突变型PUMA蛋白比野生型PUMA蛋白有一个更高的稳定状态.转染24 h后诱导表达野生型和突变型的PUMA细胞中均加入放线菌酮,结果表明,突变型PUMA蛋白降解延迟、半衰期延长;光密度值测定结果显示细胞转染两种质粒后,细胞存活率随着时间的延长逐渐下降,且转染突变型PUMA质粒在24、48 h的存活率均比野生型PUMA组低(P＜0.05,P＜0.01);流式细胞术结果显示,随着PUMA转染时间的增加,野生型和突变型两组肿瘤细胞的凋亡率均逐渐升高,并且突变型组细胞比野生型组细胞的凋亡率增加更加明显(P＜0.05,P＜0.01).结论 PUMA具有抑制Hela细胞增殖、促进其凋亡的作用,而其10号位的丝氨酸被丙氨酸取代后增加了突变型PUMA的稳定性、延长了其半衰期,导致突变型比野生型PUMA对Hela细胞的抑制作用及促凋亡功能得到加强.     

靶向热休克蛋白-27基因沉默对5-氟尿嘧啶诱导SW480细胞凋亡的影响及机制

目的：通过RNA干扰抑制热休克蛋白-27（HSP27）基因的表达,探讨沉默该基因对5-氟尿嘧啶（5-FU）诱导大肠癌SW480细胞凋亡的影响及机制。方法：将细胞分为正常对照组（Normal组）、阴性siRNA转染组（NC组）、HSP27-siRNA转染组（siRNA组）、单纯5-FU组（5-FU组）、5-FU+阴性siRNA转染组（NC+5-FU组）、5-FU+HSP27-siRNA转染组（siRNA+5-FU组）,通过脂质体LipofectamineTM 2000将HSP27-siRNA导入SW480细胞,CCK-8法检测靶向HSP27的siRNA和5-FU对SW480细胞增殖的抑制作用,流式细胞技术观察转染后细胞在5-FU作用下的早期凋亡情况,Western blot方法检测凋亡相关蛋白Active-casepase-3、Active-caspase-9及细胞色素C（Cytc）的表达。结果：CCK-8法检测结果显示siRNA+5-FU组细胞增殖抑制率明显高于同期siRNA组和5-FU组,表明联合应用抑制率明显升高（P＜0.05）。流式细胞仪检测结果表明siRNA组和5-FU组均可诱导SW480细胞凋亡,两者联合应用细胞早期凋亡率明显升高,与Normal组及NC组比较,差异均有统计学意义（均P＜0.05）;Western blot检测结果显示siRNA+5-FU组Active-casepase-3、Active-caspase-9、Cytc蛋白相对表达水平均高于siRNA组和5-FU组,差异均有统计学意义（均P＜0.05）。结论：靶向HSP27-siRNA能有效抑制大肠癌SW480细胞HSP27蛋白的表达,上调Active-casepase-3、Active-caspase-9、Cytc蛋白的表达,增强5-FU诱导SW480细胞凋亡,逆转肿瘤细胞对5-FU的耐药。     

miR-483-5p 通过靶基因 ERK1调控人类颗粒细胞增殖凋亡平衡

目的：证明 miR-483-5p 及其靶基因 ERK1参与调控人类颗粒细胞增殖凋亡平衡。方法①体外培养人正常颗粒细胞,调控其 miR-483-5p 超表达,聚合酶链反应（PCR）及Western blot 法检测 ERK1的 mRNA 及蛋白表达情况;将包含野生型或突变型的 ERK1 mRNA 3′UTR 的 DNA 片段克隆在荧光素酶标记的质粒,共转染 miR-483-5p mimics、control-miR mimics 和野生型、突变型重组质粒,检测其颗粒细胞相对荧光素酶活性;②将 miR-483-5p mimics 及 ERK1 siRNAs单独及共同转染颗粒细胞,MTT 法及 TUNEL 法分别检测三种情况下卵巢颗粒细胞的增殖、凋亡情况。结果① miR-483-5p 超表达后,ERK1基因及蛋白表达均下降;与 control-Wt（野生型）转染组相比,miR-483-Wt 组的荧光素酶活性显著降低;miR-483-Mut（突变型）与 control-Mut 转染组间荧光素酶活性的比较差异无统计学意义;② miR-483-5p mimics与 ERK1 siRNAs 单独及共同转染颗粒细胞,三种转染条件下颗粒细胞增殖均显著受抑制、凋亡率显著升高,且三种作用效果差异无统计学意义。结论 miR-483-5p 通过直接与靶基因 ERK1结合,参与调控人类颗粒细胞增殖凋亡平衡。     

靶向4-1BBL基因siRNA抑制HL-60B细胞生长的体外研究

目的：观察4-1BBL基因小分子干扰RNA（siRNA）对HL-60细胞生长及诱导其凋亡作用的影响。方法：化学合成法合成靶向人4-1BBL基因siRNA,脂质体转染法转染HL-60B细胞;半定量PCR和流式细胞术检测转染前后HL-60B细胞4-1BBL的表达水平,MTT法检测HL-60B细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡。结果：靶向4-1BBL基因siRNA转染HL-60B细胞后,4-1BBLmRNA和蛋白的表达明显降低;细胞增殖被抑制,其抑制作用在转染后48h最明显,增生抑制率达到（22.1±2.3）%;细胞凋亡率增加,由（9.8±2.5）%上升到（32.5±5.1）%。结论：化学合成的siRNA在体外能成功抑制靶基因4-1BBL的表达和HL-60B细胞的增殖,并有助于细胞趋向凋亡。     

转染野生型p53基因对肝癌细胞生长的影响

目的：通过转染野生型p53基因致肝癌细胞株BEL-7404，研究其对肝癌细胞的生长及凋亡作用。方法：野生型p53基因通过脂质体Lipofectamine介导转染人肝癌细胞株BEL-7404。用四甲基偶氮唑（MTT）法测定细胞生长曲线，用流式细胞仪进行细胞凋亡分析。结果：肝癌细胞BEK-7404转染野生型p53基因后，其生长作用明显受到抑制．细胞生长抑制率在第4天可达50．8％。流式细胞仪分析细胞凋亡结果：阴性对照组为1．7％，转染pUHD10-3组为3．2％．转染pUHD10-3-p53组为40．7％。结论：野生型p53基因可诱导肝癌细胞BEL-7404的生长抑制及发生凋亡。     

不同类型的DNA聚合酶β基因对CHO细胞的影响

目的:比较野生型和突变型(58 bp缺失)DNA聚合酶β(polβ)基因对真核细胞生长特性的影响. 方法:将表达人野生型和缺失型DNA polβ的中国仓鼠卵巢细胞株(CHO),用RT-PCR方法鉴定野生型和缺失型DNA polβ mRNA水平的表达,MTT法测生长曲线、流式细胞术测细胞周期. 结果:转染野生型和突变型DNA polβ的CHO细胞株中,都有外源基因mRNA水平的表达;转染突变型(58 bp缺失)polβ基因的细胞增殖速度和S期比例增高均高于未转染组细胞,差异有统计学意义(P<0.05). 而转染野生型polβ基因对细胞增殖速度和细胞周期无明显影响(P>0.05). 结论:高表达外源性野生型和突变型DNA polβ,对CHO细胞生长具有不同的影响.     

SEDL基因突变致迟发性脊柱骨骺发育不良机制的初步研究

目的迟发性脊柱骨骺发育不良（spondyloepiphyseal dysplasia tarda,SEDT）是一种X线表现明显的X连锁骨发育不良疾病,主要特征包括不成比例的短躯干型矮身材、大关节发育不良以及胸腰椎椎体扁平。文中初步研究SEDL基因突变致SEDT的机制。方法将野生型SEDL基因及其突变型（c.370-371insA）重组真核表达质粒分别转染COS-7细胞,通过流式细胞仪检测转染效率,激光共聚焦显微镜下观察重组蛋白表达的亚细胞定位,应用透射电镜观察转染细胞的超微结构。结果野生型和突变型重组质粒的转染效率分别为47.51%和46.39%。野生型重组Sedl-in蛋白主要定位于核周,而突变型Sedlin蛋白则主要分布于细胞核以及部分在胞质表达。超微结构显示转染SEDL突变型重组质粒的细胞溶酶体显著增多。结论SEDL基因c.370-371insA突变导致Sedlin蛋白细胞定位的变化可能是SEDT发病的分子机制。     

胱天蛋白酶3介导BAG3蛋白剪切的研究

  目的 解析胱天蛋白酶（caspase）3介导BCL2结合抗凋亡基因3（BAG3）酶切的具体作用靶点,明确caspase 3裂解对BAG3抗凋亡作用的影响。方法 采用生物信息学方法筛选BAG3蛋白序列中潜在胱天蛋白酶caspase酶切位点;采用定点突变法构建潜在胱天蛋白酶caspase酶切位点突变体;体外翻译野生型和突变体BAG3蛋白;利用重组胱天蛋白酶caspase对野生型或突变型重组BAG3蛋白进行体外剪切实验;构建BAG3裂解片段的真核表达载体,突变型或片段BAG3表达载体转染SW1990细胞;利用Western blot检测各组细胞中BAG3蛋白的裂解情况;利用流式细胞仪（FCM）检测细胞凋亡率。结果 在BAG3蛋白序列中存在K344EVD347和L515EAD518 2个潜在胱天蛋白酶caspase酶切位点;胱天蛋白酶caspase3可有效剪切D518A突变型BAG3,而不能剪切D347A突变型BAG3;D518A突变型和野生型BAG3同等程度抑制MG132诱导的细胞凋亡,D347A突变型BAG3对细胞凋亡的保护作用高于D518A突变型或野生型BAG3,而N末端和C末端剪切片段BAG3对MG132诱导的细胞凋亡无作用。结论 胱天蛋白酶caspase3主要在D347位点裂解BAG3蛋白;BAG3在D347位点的剪切使其丧失了原有的抗凋亡作用。     

HePTP抑制BCR诱导的未成熟B淋巴细胞的凋亡

目的 研究血细胞专有的酪氨酸磷酸酶（hematopoietic protein tyrosine phosphatase，HePTP）在B细胞凋亡研究模型[B细胞表面抗原受体（B-call antigen receptor，BCR）诱导的WEHI231细胞的凋亡]中的作用及机制。方法 HePTP是BCR诱导WEHI231细胞发生凋亡的信号传导通路中ERK和p38激酶的调节因子。应用PCR定点突变的方法，构建起含有功能性突变的HePTP基因的逆转录病毒载体。将野生型与突变型质粒转染BOSC23细胞，收集病毒上清，感染WEHI231细胞后，加入anti-IgM诱导凋亡，流式细胞仪检测被感染细胞的凋亡情况。western印迹检测野生型及突变型HePTP的表达及作用。结果 野生型HeFTP基因的过量表达抑制WEHI231细胞的凋亡，而失去与底物作用位点及催化域失活的突变型基因的过量表达则均没有抑制凋亡的作用。结论 HePTP抑制BCR诱导的未成熟B淋巴细胞的凋亡，与MAPK底物结合，并同时使其磷酸化的水平发生变化，是HePTP发挥抗凋亡作用的两个必要条件。     

XIAP表达水平对5-Fu诱导肝癌细胞凋亡的影响

目的研究XIAP mRNA及蛋白表达水平对不同剂量5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-Fu）诱导人肝癌细胞HepG2凋亡的影响。方法脂质体介导含XIAP基因全长的质粒pef-XIAP转染人肝癌细胞HepG2,采用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）及western blotting检测XIAP基因和蛋白表达水平。通过不同剂量5-Fu诱导细胞凋亡,使用CCK-8试剂通过比色法分析检测5-Fu对转染pef-XIAP的HepG2细胞生长活性的抑制作用。结果各组HepG2细胞在不同剂量的5-Fu诱导下发生凋亡、与普通HepG2细胞组比较．转染XIAP基因的HepG2细胞组的凋亡率显著降低。结论XIAP基因在人肝癌细胞HepG2中的高表达可以明显降低化疗药物5-Fu诱导的细胞凋亡,其可能在肝癌化疗耐药中起一定作用。     

自杀基因修饰内皮祖细胞对肝细胞癌体外作用的效应

目的：研究自杀基因胞嘧啶脱氨酶（CD）基因转染的小鼠骨髓源性内皮祖细胞（EPCs）联合酶前体药物5-氟胞嘧啶（5-FC）对小鼠肝癌细胞株H22的体外抗增殖作用。方法：分离普通小鼠骨髓源性EPCs,培养鉴定,Polybrene技术转染含CD基因的慢病毒载体重组体plenti6．3-EGFP-CD至EPCs,Western blotting检测目的蛋白的表达。利用Transwell小室共培养体系,用转染CD基因的EPCs处理H22细胞。 CCK-8法检测H22细胞增殖变化,流式细胞仪检测细胞凋亡水平。结果：成功转染CD基因至EPCs;CCK-8法检测显示随着5-FC浓度增加,细胞增殖逐渐下降,5-FC浓度达100 mg· L-1时,肿瘤细胞增殖抑制率达到（54．74±5．38）％（P＜0．05）,细胞平均凋亡率为（48．71±4．62）％（P＜0．05）。结论：CD基因修饰的EPCs 联合5-FC体外可明显抑制肝癌H22细胞增殖,诱导肿瘤细胞凋亡。     

人金属硫蛋白1H基因对肺腺癌细胞A549耐药性的影响

目的：探讨金属硫蛋白1H（metallothionein 1H,MT1H）基因对人肺腺癌A549细胞耐药性的影响．方法：构建真核表达载体pcDNA3．1（-）-MT1H,利用脂质体介导将其转染肺腺癌A549细胞,G418筛选阳性克隆．分别以RT—PCR和Western方法检测MTIH mRNA和蛋白表达情况,MTT法检测细胞对顺铂的药物敏感性;流式细胞仪（FCM）检测顺铂诱导细胞凋亡率．结果：转染pcDNA3．1（-）-MT1H的细胞,其MT1H mRNA和蛋白表达水平显著高于亲本细胞及转染空载体细胞,细胞对顺铂药物敏感性明显下降,顺铂诱导的凋亡率明显降低．结论：MT1H能促进A549细胞耐药,可能和降低顺铂诱导细胞凋亡有关．     

核因子—kB在TNF—α诱导HL—60细胞凋亡中的作用

目的 了解白血病细胞系HL-60中，肿瘤坏死因子-α（TNF-α）诱导的核因子-kB(NF-kB）活化与细胞凋亡之间的关系。方法 采用脂质体基在转染技术，将突变的核因子抑制蛋白（IkBα）质粒（PCMV4-1kBαS32//36∧）转染HL-60细胞，于48后测其瞬时表达效应。用间接免疫荧光和Western blot技术检测转染组和诱导及生长抑制效应。结果 TNF-α可诱导非转染组HL-60细胞的NF-kB活化，不能诱导转染组细胞的NF-kB活化，即突变型IkBα可特异性抑制HL-60细胞的NF-kB活化。结论 用突变型IkBα特异性抑制HL-60细胞的NF-kB活化，能明显增加其对TNF-α的敏感性。     

转染wt-53基因对SHG44细胞恶性表型的影

目的：转染ｗｔ－ｐ５３基因对ＳＨＧ４４细胞恶性表型的影响。方法脂质体介导法,将ｗｔ－ｐ５３基因转导入ＳＨＧ４４人胶质瘤细胞,斑点霜交证实转染成功;观察阳性转染细胞在体外常规培养中生长速率,细胞培增时间;平板集落形成率,结果转染ｗｔ－ｐ５３的细胞生长速度明显减慢,倍增时间延长（Ｐ〈０．０１）;细胞集落形成数明显减少（Ｐ〈０．０１）,结论外源性野生型Ｐ５３基因对ＳＨＧ４４细胞的恶性表型有抑制作用。     

BRD4基因对TGF-β1诱导的心肌细胞凋亡和p38MAPK信号通路的影响

目的：探讨溴结构域蛋白4（BRD4）基因对转化生长因子β1（TGF-β1）诱导的心肌细胞凋亡的影响,阐明其可能的作用机制。方法：将H9c2细胞分为空白对照组、si-CN组（转染阴性对照siRNA）和si-BRD4组（转染特异性siRNA）,采用Western blotting法检测各组细胞中BRD4蛋白表达水平。大鼠心肌H9c2细胞随机分为对照组、TGF-β1组（20μg·L^-1TGF-β1处理细胞24 h）、si-NC+TGF-β1组（转染阴性对照的siRNA后,使用TGF-β1处理细胞24 h）和si-BRD4+TGF-β1组（转染BRD4特异性siRNA后,使用TGF-β1处理细胞24h）。MTT法检测各组细胞增殖活性,Annexin Ⅴ-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率,Western blotting法检测各组细胞中BRD4、B淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相关X蛋白（Bax）、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Cleaved caspase3）、P38和磷酸化P38（p-P38）蛋白表达水平。结果：与空白对照组比较,si-BRD4组H9c2细胞中BRD4蛋白表达水平明显降低（P<0.01）。与对照组比较,TGF-β1组细胞增殖活性明显降低（P<0.05）,细胞凋亡率明显升高（P<0.05）,Bcl-2蛋白表达水平明显降低（P<0.01）,Bax、Cleaved caspase3和p-P38蛋白表达水平均明显升高（P<0.01）;与TGF-β1组比较,si-BRD4+TGF-β1组细胞增殖活性明显升高（P<0.05）,细胞凋亡率明显降低（P<0.05）,Bcl-2蛋白表达水平明显升高（P<0.05）,Bax、Cleaved caspase3和p-P38蛋白表达水平均明显降低（P<0.05）。结论：抑制BRD4基因表达可减弱TGF-β1诱导的心肌细胞凋亡,其机制可能与抑制P38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路有关。     

p73β基因转染对胃癌细胞的生物学影响

目的研究人p73β基因转染对人胃癌细胞SGC-7901的生物学影响,探讨p73β基因抑制SGC-7901细胞增殖的机制。方法用脂质体转染法瞬时转染SGC-7901细胞,转染重组质粒pcDNA3.1-p73β（SGC-7901-pcDNA3.1-p73β组）和空载质粒pcDNA3.1-N0（SGC-7901-pcDNA3.1-N0组）,并用未转染质粒具有相同遗传背景和代数的SGC-7901细胞作为空白对照（SGC-7901组）。逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测细胞中P73β、p21、c-myc表达量变化,MTT法观察细胞增殖的活力,原位细胞凋亡检测TUNEL法观察细胞凋亡。结果RT-PCR检测发现SGC-7901-pcDNA3.1-p73β组细胞与SGC-7901-pcDNA3.1-N0和SGC-7901两对照组相比,其p73β表达明显增高,p21相对表达量明显增多,c-myc相对表达量明显减少。与两对照组相比,SGC-7901-pcDNA3.1-p73β组细胞增殖率明显减弱,细胞凋亡率明显增高（均P〈0.05）。结论p73β基因可以促进SGC-7901细胞内p21基因的表达,抑制c-myc基因表达。p73β基因可降低胃癌细胞增殖力,诱导胃癌细胞凋亡。