脂质体介导胰岛素样生长因子-1基因修饰骨髓间充质干细胞成软骨分化

目的脂质体介导IGF-1目的基因转染骨髓间充质干细胞（MSCS），并研究对MSCS成软骨分化的特异性细胞外基质的影响。方法以密度梯度离心结合全骨髓培养法获得纯化骨髓间充质干细胞（MSCs），经流式细胞仪检测，细胞表面标志CD29和CD44表达阳性，但是CD14和CD45表达阴性。采用脂质体介导法将重组真核表达质粒pcDNA3．1-IGF-1转染MSCs，对转染后骨髓间充质干细胞的Ⅱ型胶原（ColⅡ）的表达行Western blot检测。结果获得纯度较高的兔骨髓间充质干细胞（MSCs）；脂质体为介导将全长兔IGF-1目的基因导入MSCs，Western blot鉴定转染成功，转染后的MSCs较未转染MSCs成软骨分化特异性细胞外基质ColⅡ、蛋白表达明显增强。结论以脂质体介导法可以将IGF-1目的基因转染骨髓间充质干细胞，转染后成软骨分化的特异性细胞外基质增多。     

hBcl-2和hVEGF165双基因重组腺病毒载体转染大鼠骨髓间充质干细胞的实验研究

目的 将hBcl-2和hVEGF165双基因共表达重组腺病毒载体转染大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs),检测目的 基因的表达及表达产物的生物学效应.方法 贴壁培养法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞;重组腺病毒转染BMSCs,用PCR法验证目的 基因mRNA在间充质干细胞中的表达;用ELISA及Western Blot检测双...     

hVEGF165在自体骨髓间充质干细胞移植治疗兔缺血后肢中的表达

目的 观察hVEGF165在自体骨髓间充质干细胞移植治疗兔缺血后肢中的表达.方法 体外培养兔骨髓问充质干细胞,通过腺病毒载体转染hVEGF165基因.移植后4周内,采用RT-PCR法鉴定hVEGF165在兔缺血后肢中的表达.结果 hVEG165成功转染骨髓间充质干细胞,移植后在兔缺血后肢中有效表达.结论 hVEGF165转染干细胞后能在体内有效表达.     

血管内皮细胞生长因子基因在骨髓间充质干细胞中的表达

目的： 研究血管内皮细胞生长因血管内皮细胞生长因子基因在骨髓间充质干细胞中的表达子（VEGF）基因转染兔骨髓间充质干细胞（MSCs）后的表达和分泌情况,为构建一种血供丰富、成骨能力及骨块存活能力更强的组织工程化人工颅骨奠定实验室基础。方法： 应用基因重组技术,将VEGF165基因全长片段克隆于真核表达载体pcDNA3中,构建pcDNA3-VEGF165真核表达质粒;应用阳离子脂质体介导的基因转染技术,将pcDNA3-VEGF165真核表达质粒转染进入兔骨髓间充质干细胞中;利用RT-PCR及Western blotting方法检测VEGF基因在MSCs中的表达情况。结果： 构建的真核表达质粒-pcDNA3-VEGF165经双酶切后分别在5 400 bp和600 bp处出现条带,证实其构建成 功;成功进行了兔MSCs的原代及传代培养,并建立兔MSCs库,原代细胞初为淋巴细胞样小圆细胞,此后逐渐变为圆形、梭形或不规则形,而传代细胞则变为形态更均一、排列更有序的成纤维细胞样细胞;RT-PCR及Western blotting检测到瞬时转染后的细胞有VEGF mRNA及VEGF蛋白的表达。结论： pcDNA3-VEGF165真核表达质粒通过脂质体能够有效转染兔MSCs,转染后的细胞具有表达VEGF蛋白的能力。     

人骨髓间充质干细胞分离培养鉴定及VEGF基因的转染

目的：探讨人骨髓间充质干细胞（hMSC）分离培养、鉴定方法及人血管内皮生长因子（hVEGF）165基因转染hMSC后表达情况,拟构建血管化组织工程皮肤.方法：用密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞,筛选贴壁细胞培养并传代.观察细胞形态,生长情况.检验细胞CD44、CD29、CD14、CI45等表面标记.利用基因重组技术,构建pCDN3.1＋VEGF表达质粒,并将其转染第3代hMSC.经G418抗性筛选后扩大培养并用Western blot实验检测其蛋白产物.结果：骨髓密度梯度离心法分离hMSC,接种培养瓶后26 h呈对数生长,6d后达到高峰.hMSC表达CD29,CD44,不表达造血细胞标记物CD14和CD45.通过酶切鉴定验证成功构建pCDN3.1＋ VEGF表达质粒.Western blotting实验证实转染后hMSCs表达VEGF增加.结论：成功建立hMSC分离培养鉴定体系.利用基因重组技术可成功将hVEGF基因导入hMSC并产生预期效应.     

血管内皮生长因子基因在兔骨髓间充质干细胞中的转染和表达

目的：探讨应用人血管内皮生长因子165 (hVEGF₁₆₅)进行基因修饰的可行性，为血管化组织工程组织的构建及缺血性疾病的治疗奠定实验基础。方法：构建pcDNA3.0-VEGF₁₆₅真核表达载体，利用脂质体介导转染兔骨髓间充质干细胞（MSCs），ELISA方法检测转基因MSCs的hVEGF蛋白表达情况，MTT法检测转基因MSCs表达物对血管内皮细胞增殖活性的影响，设单纯培养MSCs及pcDNA3.0转染MSCs组为对照组。结果：成功构建hVEGF真核表达载体，并成功地将其转入MSCs中；MSCs细胞在转染 pcDNA3.0-VEGF₁₆₅ 质粒24、48和72 h后，其培养上清中hVEGF蛋白表达量均较对照组显著升高（P<0.05），至G418筛选后12代，转基因MSCs培养上清中仍有hVEGF蛋白的表达，含2%、4%、8%、16%和32%转基因细胞培养上清的培养液均明显增加血管内皮细胞的增殖率，与对照组比较，差异均具有显著性（P<0.05）。 结论： hVEGF₁₆₅基因成功地转染至MSCs中，并可进行有效地表达。     

脂质体介导转化生长因子-β1基因修饰骨髓间充质干细胞成软骨分化

目的 脂质体介导TGF-β1目的基因转染骨髓间充质干细胞(MSC)，研究对MSC成软骨分化的特异性细胞外基质的影响。方法 以梯度离心结合换液法获得并纯化骨髓间充质干细胞(MSCs)，采用脂质体介导法将重组真核表达质粒pcDNA3-TGF-β1转染MSCs，Rr-PCR和Western blot鉴定后，对转染后骨髓间充质干细胞的Ⅱ型胶原(ColⅡ)、纤维连接蛋白(FIN)的表达行RT-PCR和Western blot检测。结果 获得纯度较高的成年中国小型猪骨髓间充质干细胞(MSCs)；脂质体为介导将全长人TGF-β1目的基因导入MSC，经RT-PCR和Western blot鉴定转染成功，转染后的MSC较未转染MSC成软骨分化特异性细胞外基质ColⅡ、FNmRNA和蛋白表达明显增强。结论以脂质体介导法可以将TGF-β1目的基因转染骨髓间充质干细胞，转染后成软骨分化的特异性细胞外基质增多。     

重组共表达质粒pIRES-hVEGF121 cDNA/hBMP-4在大鼠骨髓间充质干细胞中的共表达

目的观察重组共表达质粒pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4转染大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)后的共表达情况,为骨缺损的联合基因治疗奠定基础。方法使用全骨髓培养法分离、培养大鼠MSCs;重组共表达质粒pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4经酶切鉴定后,在脂质体介导下将其转入大鼠MSCs,提取总RNA和总蛋白,进行RT-PCR和Western blot检测。结果重组共表达质粒pIRES-hVEGF121cDNA/hBMP-4成功转染至大鼠MSCs中,并获得有效表达。结论hVEGF121和hBMP-4在大鼠MSCs中获有效表达,为骨缺损的联合基因治疗奠定了基础。     

pcDNA3.1(+)/VEGF165质粒转染骨髓内皮祖细胞后VEGF165的表达

目的:培养和鉴定大鼠内皮祖细胞(Endothelial progenitor cells,EPCs),观察pcDNA3.1(+)/VEGF165质粒转染大鼠骨髓内皮祖细胞后内皮细胞生长因子165(Vascular endot-helial growth fator-165,VEGF165)的表达.方法:体外培养内皮祖细胞,以免疫细胞化学法检测其表面抗原(CD34、CD133、KDR)的表达.通过pcDNA3.1(+)质粒转染VEGF165后,采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测内皮祖细胞培养上清液中VEGF蛋白的水平,反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测内皮祖细胞中VEGF165mRNA的表达.结果:免疫细胞化学检测表明培养的细胞为大鼠内皮祖细胞,PCR后凝胶电泳显示pcDNA3.1(+)/VEGF165质粒转染组在576 bp处可见有明显条带,pcDNA3.1(+)空质粒转染组和未转染组可见微弱的电泳带位于500 bp与600 bp之间,约576bp大小.ELISA检测结果为pcDNA3.1(+)/VEGF165质粒转染组上清液中VEGF165水平为(175.8±10.7)pg/ml,pcDNA3.1(+)空质粒组为(10.5±1.6)pg/ml,未转染组为(9.3±1.3)pg/ml.结论:内皮祖细胞体外培养有微量VEGF165表达,应用pcDNA3.1(+)/VEGF165载体转染,可使SD大鼠内皮祖细胞高效表达VEGF165.     

大鼠骨髓间充质干细胞向表皮细胞分化的初步研究

目的体外分离培养骨髓间充质干细胞,并探索表皮细胞生长因子诱导MSCs分化的潜能及条件.方法采用直接贴壁法,分离培养大鼠股骨和胫骨骨髓间充质干细胞,应用免疫细胞化学法检测细胞CD44、CD106、CD29、CD90、CD34等,对分离的细胞进行鉴定.以10～40 ng/ml的表皮生长因子处理第3代MSCs,观察细胞角蛋白的表达.用Western blot方法摸索integrin β1的表达与MSCs分化状态的关系.结果原代培养的骨髓间充质细胞CD44、CD106、CD29、CD90免疫细胞化学染色为阳性,CD34为阴性,符合骨髓间充质干细胞特征.MSCs经不同浓度的EGF体外诱导7 d后,免疫细胞化学结果显示,EGF浓度为30 ng/ml和40 ng/ml时,细胞角蛋白出现阳性表达;体外诱导14 d,呈角蛋白染色阳性的细胞比例进一步增加,同时integrin β1表达量下降.结论体外培养的MSCs在EGF诱导下,具有分化为表皮细胞的倾向,同时integrin β1可能在MSCs分化中具有一定的作用.     

血管内皮生长因子转染骨髓间充质干细胞心肌移植对心肌梗死后大鼠心功能及血管新生的作用

目的建立重组人血管内皮生长因子(VEGF)165基因转染大鼠骨髓间充质干细胞(MSC)的方法,探讨该细胞心肌移植对缺血性心脏病心功能及血管新生的影响,并比较联合治疗与单独基因或细胞治疗的疗效差异。方法采用密度梯度离心-贴壁培养法获取Wistar近交系大鼠MSC,用脂质体将pcDNA3.1-hVEGF165转入该细胞,通过ELISA、RT—PCR和Western印迹检测后者VEGF的表达情况;以Wistar近交系大鼠建立心肌缺血模型,随机分成4组(每组12只),心肌梗死模型建立2周后,联合组在心肌梗死区移植转染VEGF165基因的MSC,细胞组移植等量的MSC,基因组注射脂质体-pcDNA3.1-VEGF165DNA复合物,对照组注射等容积培养液;另取12只未结扎冠脉的大鼠为假手术组。细胞移植4周后,用Buxco系统检测心功能;然后处死动物,取心肌标本,测量心肌梗死面积;用5-溴脱氧尿嘧啶(Brdu)、肌钙蛋白T免疫组化双染法确定移植细胞的存活与分化;用Ⅷ因子染色法检测血管新生,RT-PCR法检测VEGF165基因的体内表达情况。结果(1)pcDNA3.1-hVEGF165基因通过脂质体转染大鼠MSC后获稳定表达;(2)移植4周后,联合组心肌梗死面积(27．8％±3．0％)明显低于细胞组(37．0％±10．1％)与基因组(37．1％±5．2％,均P<0．05),心功能改善优于细胞组与基因组;(3)联合组心肌梗死区毛细血管密度(每视野40．2个±5．5个)高于细胞组(27．2个±6．3个,P<0．01)和对照组(18．5个±5．8个,P<0．01),较基因组(35．8个±7．7个)亦有增加的趋势(P=0．189);(4)Brdu、肌钙蛋白T双染示各治疗组心肌梗死区心肌细胞数量不同程度的多于对照组;(5)联合组VEGF基因的体内表达(hVEGFmRNA相对含量0．18±0．04)高于基因组(0．10±0．03,P<0．01)。结论转染VEGF基因的MSC移植可使鼠冠脉结扎造成的心肌梗死面积缩小、心功能明显改善,其疗效优于单独应用基因或细胞治疗,为缺血性心脏病的细胞基因联合治疗提供了理论依据。     

pIRES2-EGFP-hVEGF165真核表达载体的构建及在心肌细胞内的表达

目的：构建plRES2-EGFP-hVEGF165真核表达质粒并在心肌细胞内表达．方法：应用限制性内切酶将目的片段VEGFl65克隆入含有增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因的真核表达质粒plRES2-EGFP中．转染心肌细胞后，应用荧光显微镜检测EGFP的表达，以免疫组化法检测血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)在体及离体表达．结果：构建了真核共表达载体plRES2-EGFP-hVEGF165．转染心肌细胞后，荧光显微镜观察可见EGFP的表达，免疫组化染色证实细胞内有VEGF的表达．结论：外源性hVEGF165基因可在心肌细胞内稳定表达．     

人血管内皮生长因子165慢病毒载体的构建及其抗放射所致细胞凋亡的作用

 【目的】 构建人血管内皮生长因子165(hVEGF165)慢病毒表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFPhVEGF165,并转染至HT22 细胞,并进一步观察其对放射线损伤所致的细胞凋亡的保护作用。【方法】 PCR扩增hVEGF165基因,克隆到pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP载体;通过酶切电泳,菌落PCR初步筛选和测序鉴定构建的pCDH-CMV-MCS-EF-GFP1-hVEGF165重组载体;采用磷酸钙共转染法转染293T细胞包装制备慢病毒液,并感染HT22细胞,采用实时RT-PCR及Western Blot检测hVEGF165基因在HT22细胞中的表达情况。进一步对单纯HT22细胞、空质粒转染组以及hVEGF165转染组HT22细胞进行0、5、10 Gy的X线照射,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。【结果】 hVEGF165基因片段重组到pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP载体,酶切后电泳结果显示均能得到与理论大小相符的片段,测序结果与GenBank序列完全一致,转染HT22后hVEGF mRNA及蛋白表达水平明显增高。而且同各对照组相比,hVEGF165可以降低细胞放疗后的凋亡率。【结论】 pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-hVEGF165 慢病毒表达载体构建成功,其转染HT22细胞后可获得高水平hVEGF165 mRNA和蛋白的表达,hVEGF165具有抗放射所致细胞凋亡的作用。     

靶向hVEGF165基因shRNA质粒表达载体的构建及筛选

目的 构建编码hVEGF165 mRNA的shRNA质粒表达载体,并筛选出基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体.方法 以hVEGF165 mRNA编码区中第5和第7外显子序列作为RNA干扰靶点,分别构建3个shRNA质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体并通过PCR进行鉴定.经鉴定后分别转染稳定表达hVEGF165基因的BHK细胞,实时荧光定量PCR和Western blotting分别从mRNA和蛋白质水平检测抑制效果.结果 构建的质粒表达载体PCR鉴定均可扩增出预期条带,构建成功.靶向hVEGF165基因的shRNA对所转染稳定表达hVEGF165基因的BHK细胞中hVEGF165基因mRNA和蛋白质表达均有抑制作用,其中shRNA2最为明显.结论 成功构建了靶向hVEGF165基因的shRNA质粒表达载体,其中抑制效果最为明显的shRNA质粒表达载体为pDC316-EGFP-U6-shRNA2质粒.     

人血管内皮细胞生长因子165重组腺病毒的构建及其在真核细胞中的表达

目的:体外构建人血管内皮生长因子165(hVEGF165)的腺病毒表达载体,并检测其在HEK293细胞中的表达。方法:从重组质粒pcDNA3/hVEGF165中获得hVEGF165,经酶切及测序鉴定,将hVEGF165基因亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV,重组穿梭质粒经酶切线性化后,与pAEdasyl质粒在大肠杆菌BSJ183中进行同源重组,线性化后转染HEK293细胞进行包装扩增获取重组病毒上清,同时应用RT-PCR及ELISA法检测hVEGF165的表达。结果:目的基因的测序结果与人VEGF165序列(Genbank)相符。转染后经RT-PCR和ELISA检测证实转染重组质粒组hVEGF165 mRNA及蛋白表达,而转染空质粒组及未转染组没有检测到hVEGF165的表达。结论:本研究构建了人VEGF165重组腺病毒表达载体pAd-hVEGF165,并能成功地在HEK293细胞中表达。     

血管内皮细胞生长因子在哺乳动物细胞的表达

目的：本实验试图构建具有生物学活性的ＶＥＧＦ真核表达载体,为ＶＥＧＦ基因治疗提供载体。方法：将已获得的ｈＶＥＧＦ１６５ ｃＤＮＡ克隆到ＧＳＴ融合表达载体,构建原核表达质粒,转染大肠杆菌ＤＨ５α,ＩＰＴＧ诱导表达,Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定表达产物。在此基础上构建真核表达载体ｐｃＤＮＡ３ ／ｈＶＥＧＦ１６５,脂质体介导转染ＣＨＯ－Ｋ１细胞,Ｇ－４１８筛选,Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ,Ｗｅｓｔ－ｅｒｎ ｂｌｏｔ分别检测其在细胞内的转录和表达情况,３Ｈ－ＴｄＲ掺入法检测表达蛋白的活性。结果：实验组的Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ和Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ出现特异性条带,而对照组在相应部位未出现条带。实验组的大鼠心肌血管内皮细胞３Ｈ－ＴｄＲ掺入率明显高于对照组（Ｐ＜ ０．００１）。结论：本实验所构建的ＶＥＧＦ真核表达质粒能够在真核细胞内获得表达,其表达产物具有血管内皮细胞增殖刺激活性。     

pcDNA3.1/hVEGF165的构建及其在COS-7细胞中的表达

目的　克隆人血管内皮生长因子基因VEGF165片段,构建pcDNA3·1 /hVEGF165,观察其在COS 7细胞中的表达,为基因治疗缺血性心脏病奠定基础。方法　从胎儿心肌组织中提取总RNA,应用RT PCR方法获得hVEGF165基因,将其重组入T载体,PCR法鉴定并测序,双酶切后克隆入真核表达载体pcDNA3 1 /myc his B中,构建pcDNA3 1 /hVEGF165重组体。用脂质体介导将其转染COS 7细胞,WesternBlotting方法检测rhVEGF165的表达蛋白。结果　RT PCR方法从胎儿心肌组织获得正确的hVEGF165基因序列,成功构建pcDNA3·1 /hVEGF165且实现转染COS 7细胞的瞬时表达。结论　该实验构建的pcDNA3· 1 /hVEGF165转染真核细胞COS 7能够表达rhVEGF蛋白。     

脂质体法介导pIRES2-EGFP-hVEGF165转染人胎盘源间充质干细胞

目的：构建人血管内皮生长因子165（hVEGF165）的真核表达质粒pIRES2-EGFP-hVEGF165,通过脂质体法将其转入人胎盘源间充质干细胞(HPMSCs)中,鉴定hVEGF165的表达活性及携带目的基因的HPMSCs的多向分化潜能。方法：采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR) 技术,从人白血病细胞HL-60中扩增出hVEGF165的基因片段,构建pIRES2-EGFP-hVEGF165 重组质粒,经酶切检测其构建的正确性,通过脂质体法转染HPMSCs后分别采用RT-PCR、Western blotting 法及MTT法检测其转录和表达活性;荧光显微镜下观察增强型绿色荧光蛋白(EGFP),检测含有报告基因EGFP空载体及携带报告基因和目的基因的真核表达载体转染靶细胞的情况;并再次鉴定转染后HPMSCs的多向分化潜能。结果：成功构建重组质粒pIRES2-EGFP-hVEGF165;RT-PCR、Western blotting及MTT法检测表明,构建的质粒pIRES2-EGFP-hVEGF165具有转录及表达活性;绿色荧光显微镜下观察到EGFP表达,目的基因成功转入靶细胞,携带目的基因的HPMSCs仍保持多向分化潜能。结论：成功构建具有表达活性的hVEGF165真核表达质粒pIRES2-EGFP-hVEGF165,hVEGF165在HPMSCs中具有转录及表达活性,且对HPMSCs的增殖具有促进作用;HPMSCs本身可能具有hVEGF165的内分泌功能。