hTERT-siRNA表达载体的构建及对MCF-7细胞生长、端粒酶活性的抑制作用

目的 构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的RNA干扰(RNAi)表达载体,并研究该载体对乳腺癌MCF-7细胞端粒酶活性及细胞增殖的影响,为针对端粒酶的乳腺癌基因治疗提供新的途径.方法 设计针对人端粒酶逆转录酶催化亚基(hTERT)的干扰靶序列TGTTCAGCGTGCTCAACTA,构建重组siRNA表达质粒pGenesil-hTERT,同时构建不针对任何基因的阴性对照重组pGenesiL-HK.两种重组质粒经酶切、电泳分析和测序鉴定后,用脂质体转染法分别转染乳腺癌MCF-7细胞,应用端粒酶重复序列扩增聚合酶链反应(TRAP-PCR)及聚丙烯酰胺凝胶电泳检测端粒酶活性,流式细胞仪测定细胞凋亡率.结果 酶切电泳测序分析表明插入序列正确,重组质粒构建成功.转染pGenesil-hTERT的MCF-7细胞,凝胶电泳见端粒酶特征性条带明显减少,端粒酶活性受到明显抑制pGenesil-hTERT转染细胞后凋亡率较对照组明显升高(P＜0.01),且转染48h凋亡率最高,达54.7%±2.41%.结论 hTERT-siRNA可有效抑制乳腺癌MCF-7细胞端粒酶活性、促进细胞凋亡,此法有望应用于肿瘤基因治疗.     

载体介导的siRNA对SGC-7901胃癌细胞中hPOT1表达的抑制作用

目的构建人端粒保护蛋白（hPOT1）基因的短链干扰核糖核酸（siRNA）表达载体，观察其在胃癌细胞中抑制hPOT1基因表达的作用，为进一步研究hPOT1在胃癌细胞生长增殖中的作用打下基础。方法设计并化学合成64nt编码hPOT1 siRNA基因片段的寡核苷酸，退火成双链后将其连接到pSUPER质粒的H1 RNA启动子下游，构建psiRNA-hPOT1重组质粒。经酶切、测序鉴定后，用脂质体介导的基因转染方法，转人SGC-7901胃癌细胞，用半定量RT-PCR检测hPOT1表达水平的变化。结果测序结果表明重组质粒psiRNA-hPOT1 64个碱基成功插人到预定位置，并且序列完全一致。hPOT1 siRNA表达载体psiRNA-hPOT1转入胃癌细胞后，可明显抑制SGC-7901细胞hPOT1的表达。结论构建的hPOT1基因的siRNA表达载体psiRNA-hPOT1重组质粒能显著抑制hPOT1基因在SGC-7901胃癌细胞中的表达。     

慢病毒载体介导E6AP基因敲低乳腺癌细胞株的构建及其功能检测

目的：构建E6AP基因的小干扰RNA（siRNA）真核表达载体,并检测其对乳腺癌细胞ZR75-1生长的影响。方法利用RNA干扰（RNAi）技术设计并合成两条E6AP基因的siRNA,并将其与siRNA表达载体pSIH-H1连接。经过酶切和测序鉴定成功后,人胚肾细胞293T包装E6AP siRNA的慢病毒,然后感染乳腺癌细胞ZR75-1,建立敲低E6AP表达的稳定细胞株。稳定细胞株建立后通过实时定量PCR（ qRT-PCR）和Western 印迹等方法检测RNAi的干扰效果,并利用细胞生长实验检测E6AP siRNA对乳腺癌细胞生长的影响。结果 DNA测序证明,成功构建了E6AP siRNA的表达载体。实时定量PCR和Western 印迹实验证明,构建的siRNA确能有效抑制E6AP基因的表达,并建立了敲低E6AP表达的稳定细胞株。生长实验表明,E6AP siRNA可有效抑制细胞的生长。结论成功构建E6AP基因的siRNA真核表达载体,转染细胞后能有效地抑制E6AP基因的表达,且抑制细胞ZR75-1的生长。     

siRNA真核表达载体对大鼠耳蜗前体细胞Notch3基因表达的影响

目的 构建Notch3基因的siRNA真核表达载体,探讨其对大鼠耳蜗前体细胞中Notch3基因表达的影响.方法 机械分离并胰酶消化新生大鼠耳蜗感觉上皮,悬浮培养基培养耳蜗前体细胞.根据Notch3基因序列设计并合成2对siRNA,插入pSilencer4.1-CMV neo载体,进行酶切及测序鉴定.采用脂质体法向大鼠耳蜗前体细胞转染重组质粒,采用Real time-PCR和Western blotting法检测重组质粒对Notch3基因的干扰效果.结果 经前体细胞标记物Abcg2染色鉴定证实原代培养的细胞球为耳蜗前体细胞.酶切及测序鉴定证实成功构建了siRNA真核表达载体pSilencer-Notch3-S1和pSilencer-Notch3-S2. Real-time PCR和Western blotting检测结果显示所构建的Notch3基因真核表达载体成功地干扰了目的基因的表达.与空白对照组比较,转染pSilencer-Notch3-S1和pSilencer-Notch3-S2的细胞Notch 3 mRNA和蛋白表达量均有明显减少,而转染空质粒的细胞与空白对照组比较无显著差异.结论 成功构建了大鼠Notch3基因的RNAi真核表达载体,该载体在大鼠耳蜗前体细胞中对Notch3基因的表达可发挥抑制作用.     

DEK基因RNAi慢病毒表达载体的构建及其功能鉴定

目的：构建DEK基因的RNA干扰（ RNAi）慢病毒表达载体,并对其生物学功能进行初步检测。方法采用RNAi技术,根据DEK基因的序列,确定其有效靶序列,合成DEK基因的Oligo DNA,退火形成双链DNA,将其克隆到经BamHⅠ与EcoRⅠ酶切后的小干扰RNA（ siRNA）表达载体PSIH-H1上,产生PSIH-H1-DEK慢病毒载体,筛选阳性克隆并测序鉴定。与3个包装质粒共转染293T细胞,包装成慢病毒后感染乳腺癌细胞ZR75-1,经嘌呤霉素（ puromycin,puro）筛选2周后,收集部分细胞利用实时聚合酶链反应（ real time-PCR,RT-PCR）和Western印迹分别检验DEK在信使RNA （ mRNA ）和蛋白水平的敲低效果,并通过细胞生长实验检测DEK对人乳腺癌细胞系ZR75-1细胞生长的影响。结果 PCR和DNA测序结果证实,DEK siRNA慢病毒表达载体PSIH-H1-DEK构建成功。 RT-PCR和Western印迹结果显示,构建的DEK siRNA可有效抑制DEK基因的表达,并由此建立了敲低DEK的稳定克隆。生长曲线实验表明, DEK siRNA可抑制人乳腺癌细胞系ZR75-1细胞的生长。结论成功构建了DEK基因的RNAi慢病毒表达载体,感染人乳腺癌细胞系ZR75-1细胞后,有效沉默了ZR75-1细胞中的DEK基因的表达,为进一步研究DEK基因在乳腺癌中的作用奠定基础。     

microRNA-7真核表达载体的构建及其对细胞增殖能力的影响

目的构建miR-7真核表达载体,以研究miR-7过表达后对细胞增殖能力的影响。方法以人全血标本基因组为模板,PCR扩增miR-7序列,然后将该序列克隆入pHRS-1cla-CMV-EGFP载体中,构建pHRS-1cla-miR-7-CMV-EGFP慢病毒表达载体。将构建好的载体瞬时转染入293FT细胞中,利用RT-PCR技术对转染前后293FT细胞中miR-7的表达水平进行检测。将pHRS-1cla-miR-7-CMV-EGFP慢病毒表达载体瞬时转染入乳腺癌细胞系MCF-7中,利用CCK-8法以及BrdU增殖实验检测过表达miR-7后细胞增殖能力的变化。结果构建的pHRS-1cla-miR-7-CMV-EGFP慢病毒表达载体质粒酶切和测序鉴定结果正确,实时定量RT-PCR结果表明,与转染pHRS-1cla-CMV-EGFP对照载体细胞相比,转染pHRS-1cla-miR-7-CMV-EGFP慢病毒表达载体72 h后的293FT细胞成功地过表达miR-7达76.8倍。CCK-8法以及BrdU增殖实验检测过表达miR-7后乳腺癌细胞系MCF-7的增殖能力显著性下降（P〈0.05）。结论成功构建了pHRS-1cla-miR-7-CMV-EGFP慢病毒表达载体,瞬时转染后细胞可以有效地高表达miR-7,同时证明过表达miR-7可以使细胞的增殖能力受到明显抑制。     

人乳腺癌B7-H3分子的高表达及其抑制T淋巴细胞活化增殖作用的机制

目的探讨乳腺癌组织及细胞中高表达协同刺激分子B7-H3对T淋巴细胞作用的机制。方法 RT-PCR及流式细胞仪方法分析乳腺癌组织及细胞中B7-H3基因的高表达,以PGPU6/GFP/Neo质粒为载体,构建shRNA重组体,采用脂质体法转染乳腺癌细胞株MCF-7,采用免疫荧光标记和流式细胞术分析在MCF-7细胞上的表达。继而,利用CCK8法和酶联免疫吸附测定法（ELISA）分析B7-H3基因干扰细胞株对T细胞体外增殖和细胞因子的分泌。结果乳腺癌组织和细胞中高表达B7-H3分子,成功通过RNAi技术构建低表达B7-H3基因乳腺癌细胞株。体外生物学功能分析表明,与转染空载体的MCF-7/mock细胞相比,B7-H3表达干扰细胞能有效增强T细胞增殖以及对IFN-γ的分泌。结论乳腺癌中高表达协同刺激分子B7-H3能有效逃避T淋巴细胞对其的作用和杀伤。     

A549肿瘤细胞中特异性hTERT-siRNA的干扰作用研究

目的 研究hTERT特异的siRNA对肿瘤细胞端粒酶活性及细胞生长的抑制作用。方法 设计和构建由U6启动子驱动的产生特异hTERT的siRNA表达质粒,转染至A549肺肿瘤细胞,以TRAP-ELISA方法观察细胞端粒酶活性,Western blot检测端粒酶蛋白的表达,MTT法检测对细胞生长的影响。结果 构建的针对hTERT基因745靶位点的U6表达质粒具有明显的干扰效果,受到特异hTERT-siRNA干扰的A549肿瘤细胞端粒酶表达下调,细胞生长受抑。结论 应用RNA干扰技术可阻止hTERT基因的表达,有望成为肿瘤基因治疗新的研究方向。     

人G250真核表达载体pIRES-neo-G250的构建及表达

目的构建包含人的G250真核表达载体,并将该载体转导入293 T细胞检测其表达,为构建以G250为靶点的肾癌模型提供研究基础。方法通过聚合酶链反应获得G250基因,将其连接至PMD18T过渡载体,然后克隆到载体pIRES-neo中。把构建后的重组质粒pIRES-neo-G250转染到293 T细胞,用流式细胞仪、免疫荧光和RT-PCR检测其表达。结果 PCR扩增出的G250基因测序正确,酶切鉴定重组质粒pIRES-neo-G250正确,说明质粒构建成功;流式细胞术、免疫荧光和RT-PCT检测结果表明,重组质粒pIRES-neo-G250在293 T细胞中得到表达。结论该实验成功构建了重组质粒pIRES-neo-G250,并且在293T细胞中能够有效表达,为后续构建转染人G250的基因细胞株工作奠定了基础。     

pSUPER-Racl-siRNA质粒的构建表达及对肝癌细胞HepG2体外增殖的抑制

目的 使用pSUPER作为产生siRNA的载体,构建针对Racl的siRNA表达载体,并观察其对肝癌HepG2细胞中Racl蛋白表达的抑制作用,同时研究Racl蛋白表达抑制后肝癌细胞HepG2的体外增殖情况.方法 合成用于产生针对Racl的发卡状RNA的寡核苷酸,含64个碱基,退火后插入线性化pSUPER载体的H1启动子下游.重组载体经限制性酶切和测序,构建载体pSUPER-Racl-siRNA,并将其转染肝癌细胞系HepG2.空载体pSUPER-Control-siRNA作为阴性对照.Western blotting检测转染质粒后细胞内Racl基因的变化,MTT法检测Racl蛋白表达后体外细胞增殖情况.结果 成功构建了可以表达针对Racl的siRNA表达载体pSUPER-Racl-siRNA.转染该载体能有效地下调HepG2细胞中Racl蛋白的表达,受抑制率为82%.MTT检测结果显示,抑制Racl蛋白表达后,细胞增殖速度明显减慢.结论 成功构建了针对Racl的发卡状RNA表达载体pSUPER-Racl-siRNA,其可以高效而特异地下调HepG2细胞内靶基因Racl的表达.Racl蛋白沉默对肝癌细胞增殖具有明显的抑制作用,说明其在细胞的体外生长过程中具有重要作用.     

人hTERT基因的pCIneo真核表达载体的构建Q78

构建人端粒酶逆转录酶（hTERT）片段的基因的pCIneo真核表达载体。方法：根据hTERTmRNA序列设计引物,人胚肾转化细胞系293总RNA反转录得到的cDNA为模板,PCR扩增后克隆到载体pCIneo上,并进行酶切鉴定及测序。结果-酶切结果表明hTERT基因已经插入pCIneo真核表达载体,测序结果显示,核苷酸序列的同源性为99．89％,氨基酸序列的同源性为100％。结论：成功构建hTERT基因的pCIneo真核表达载体,为其下一步的研究奠定了基础。     

天然溶瘤新城疫病毒Italien株HN基因真核表达载体的构建和表达

目的 构建天然溶瘤型新城疫病毒(NDV)Italien株血凝素-神经氨酸酶(HN)基因的真核表达载体并进行产物表达.方法 采用RT-PCR法从病毒RNA中克隆HN cDNA,并构建HN的真核表达载体pcDNA3.1-HN,脂质体法转染CHO-K1,G418筛选稳定表达克隆.用Western blot、免疫荧光法检测HN蛋白的表达.结果 经限制性酶切鉴定及DNA测序分析,证实真核表达载体pcDNA3.1-HN构建正确.Western blot和免疫荧光分析表明HN基因在CHO-K1中成功表达.结论 天然溶瘤型NDV Italien株的HN cDNA被成功克隆,所构建的真核表达载体pcDNA3.1-HN可以在CHO-K1细胞中稳定表达.     

人源抗HBsAg dsFv抗体靶向干扰素重组质粒的构建与表达

目的构建抗体靶向干扰素的重组表达质粒pEE14.1-dsFvαpr+,并在真核细胞中验证重组质粒的表达情况。方法通过重叠延伸PCR将dsFv抗体重链基因与带正电荷的DNA负载区基因融合,并在抗体轻链α干扰素融合基因3′端连入6×His标签。先在过渡载体pCI-GPI中实现轻、重链复合基因的连接,然后连入pEE14.1中,最终构建重组表达质粒pEE14.1-dsFvαpr+。将重组质粒LipofectamineTM2000瞬时转染到CHO-K1细胞,采用RT-PCR、ELISA和Western blotting方法验证目的基因的表达。结果重组质粒经酶切鉴定和测序验证与设计完全一致。RT-PCR结果显示只有重组质粒转染后的细胞能够扩增出1700bp的目的条带,ELISA检测瞬时转染细胞上清α干扰素的浓度约为1.1ng/ml,Western blotting检测显示重组质粒在转染细胞上清中获得表达。结论实现了抗体靶向干扰素在单一质粒中的高效表达,通过对表达蛋白的电性改造有利于后期治疗慢性乙肝的抗体靶向纳米粒药物的研制。     

人MAVS小干扰RNA质粒的构建及稳定干扰MAVS细胞株的筛选

目的:构建人线粒体抗病毒信号蛋白(mitochondrial antiviral signaling protein,MAVS)的小干扰RNA真核表达质粒,并筛选出稳定干扰MAVS的细胞株.方法:根据文献报道的序列和载体的黏性末端,设计合成2条针对MAVS的DNA序列,退火后连接到载体pSUPER.retro.neo+gfp上,经测序分析正确后,质粒命名为psiMAVS.用脂质体转染质粒到MCF-7细胞中,经G418加压筛选稳定表达MAVS小干扰RNA的细胞株,用免疫印迹检测细胞中MAVS的表达情况,将干扰效果好的细胞株命名为MCF-7/siMAVS,再用荧光素酶试验检测MCF-7/siMAVS细胞对外源MAVS或poly(dA-dT)诱导干扰素-β(IFN-β)转录的情况.结果:免疫印迹结果证实建立的稳定细胞株MCF-7/siMAVS能够有效干扰MAVS的表达,并在外源MAVS或poly(dA-dT)存在的情况下,抑制IFN-β的转录活性.结论:构建了表达MAVS小干扰RNA的质粒psiMAVS.筛选出稳定干扰MAVS表达的细胞株MCF-7/siMAVS,为深入研究MAVS在先天免疫中的作用提供了平台.     

HBeAg结合蛋白4剪切体HBeBP4A基因酵母表达载体的构建及表达研究

目的 在真核生物酵母细胞中表达乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白4基因剪切体HBeBP4A基因.方法 以pcDNATM3.1/myc-HisA-HBeBP4A重组质粒作为模板,经RT-PCR扩增HBeBP4A基因,克隆到pGEM-T载体中并测序鉴定,酶切回收后连接到酵母表达质粒pGBKT7中并转化酵母AH109,色氨酸缺陷型培养基(SD/-Trp)上筛选阳性菌落,提取酵母蛋白质,行SDS-PAGE电泳和Western blotting分析.结果 成功扩增出HBeBP4A基因,测序结果符合GenBank报告序列.酶切回收的HBeBP4A基因片段成功克隆入酵母表达载体pGBKT7并转化入酵母细胞AH109中,Western blotting分析显示该基因在酵母细胞中表达,表达产物相对分子量为61.37kD.结论 成功构建了HBeBP4A酵母表达载体,并在酵母细胞中表达.     

人中性粒细胞多肽1真核表达载体的构建与表达

目的 构建人中性粒细胞多肽1(HNPl)基因真核表达载体,为探讨HNP1基因工程生产的可能性奠定基础。方法 从健康人中性粒细胞中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增出HNPl基因cDNA片段,将纯化PCR产物与pMD18-T载体连接,经酶切鉴定及测序确证,将其亚克隆入真核表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO中．用脂质体转染CA3S-7细胞,用BA-ELISA法检测转染细胞上清中HNP1的表达。结果 从人中性粒细胞中克隆出人HNP1基因,经测序分析与GenBank公布的人HNP1核苷酸序列完全一致,并在COS-7细胞中获高效瞬时表达。结论 成功构建了真核表达载体pcDNA3．1／V5-His-TOPO／HNP1,为后续哺乳动物工程细胞株的建立奠定了实验基础。     

人LDLR基因的克隆及在Hepa1-6细胞中的表达

目的 :从能感染HCV的人肝癌细胞HepG2中克隆出人LDLR基因 ,构建其真核表达质粒 ,并在小鼠肝癌细胞Hepa1 6中进行表达。方法 :从HepG2中提取总RNA ,采取逆转录PCR(RT PCR)方法得到人LDLR的cDNA。将获得的人LDLR基因克隆到真核表达载体pcDNA3中 ,进行酶切和序列鉴定。将重组质粒pcDNA3 hLDLR和空载体转入Hepa1 6 ,G4 18筛选 ,并用RT PCR和FACS检测人LDLR基因转录和蛋白的表达。结果 :人LDLR的cDNA已插入载体pcDNA3构建成真核表达质粒pcDNA3 hLDLR ,双酶切和测序表明 ,克隆的人LDLR与已登录GenBank的序列存在核苷酸多态性 ,但编码的氨基酸序列完全一致 ,该序列的GenBank登录号为gi|2 16 2 96 4 7|gb|AY114 15 5 .1,并且真核表达质粒的构建正确。用脂质体介导的方法转入Hepa1 6后 ,用RT PCR和FACS检测表明 ,细胞可表达人LDLR。结论 :成功地构建了真核表达质粒pcDNA3 hLDLR ,为进一步研究HCV和人LDLR的相互作用 ,以及建立可能的HCV细胞感染模型奠定了基础。     

丙型肝炎病毒NS5A反式激活蛋白7的重组表达及生物信息学分析

目的 构建丙型肝炎病毒NS5A反式激活蛋白7(NS5ATP7)的原核表达载体,诱导其在大肠埃希菌中的表达,并初步探讨其结构与功能.方法 应用逆转录PCR(RT-PCR)技术,以HepG2细胞mRNA为模板,扩增获得NS5ATP7基因片段,连接到pGEM-T载体,酶切鉴定及测序正确后插入至原核表达载体pET-32a( )中,转化大肠埃希菌BL21,IPTG诱导以获得NS5ATP7融合蛋白的表达,SDS-PAGE、Western blot免疫印迹分析和证实该融合蛋白表达的特异性,并应用生物信息学方法对该融合蛋白的结构和功能进行预测.结果 利用RT-PCR扩增获得大小为891bp的NS5ATP7基因片段,插入pET-32a( )表达载体,转化BL21宿主菌,经IPTG诱导,成功获得了大小为48kD的目的蛋白,Western blot进一步证实了该蛋白具有特异性免疫反应识别.生物信息学预测结果显示此蛋白富含螺旋结构,为非跨膜蛋白,无信号肽.结论 利用大肠埃希菌BL21成功表达了NS5ATP7融合蛋白,结合生物信息学分析结果,为研究NS5ATP7蛋白的免疫原性和生物学特性奠定了基础.