PTEN基因表达改变对人气道平滑肌迁移的影响

目的通过腺病毒载体体外转染人气道平滑肌细胞(HASMC),使肿瘤抑制基因PTEN过表达和RNA干扰表达,观察其对HASMC迁移的影响,并探讨其作用机制。方法利用携带野生型PTEN基因的重组腺病毒(Ad-GFP-PTEN)和针对PTEN基因的腺病毒短发夹状RNA(shRNA)载体(Ad-GFP-shRNA-PTEN)转染HASMC细胞,并以感染空载腺病毒Ad-GFP和空白组(DMEM)作为对照,用流式细胞计数确立最佳转染复数后,通过Transwell趋化小室和细胞划痕实验检测HASMC跨膜迁移能力和横向迁移能力的变化。Western blotting检测PTEN蛋白的表达和AKT、ERK1/2通路的活化情况,并加入两通路的抑制剂作为阳性对照。结果腺病毒搭载的PTEN基因过表达和干扰载体能成功改变PTEN基因的表达。上调PTEN表达能显著抑制HASMC迁移;蛋白水平上抑制PI3K/AKT通路,而MAPK/ERK通路未见变化。下调PTEN表达不能明显促进HASMC迁移;但在蛋白水平能使PI3K/AKT通路激活,而MAPK/ERK通路却受到抑制。结论上调PTEN表达能有效抑制HASMC的迁移,可能主要是通过抑制PI3K/AKT通路起作用。     

携带野生型PTEN基因的重组腺病毒治疗子宫内膜癌的体外研究

目的:观察携带野生型PTEN基因的重组腺病毒(Ad-PTEN)体外转染子宫内膜癌细胞后的表达,并探讨其对肿瘤细胞产生抑制增殖、诱导凋亡的作用及机制.方法:细菌内同源重组方法构建Ad-PTEN,体外转染PTEN基因突变的子宫内膜腺癌RL95-2细胞中,X-gal染色检测转染效率.应用RT-PCR、Western印迹、细胞免疫组化检测Ad-PTEN在RL95-2细胞中的转录及表达; 应用细胞计数、MTT实验, 观察Ad-PTEN对RL95-2细胞生长的影响;应用光镜、透射电镜观察外源性PTEN基因表达对RL95-2细胞形态学及超微结构的影响;应用流式细胞分析仪(FCM)检测Ad-PTEN对RL95-2细胞周期分布的影响、凋亡诱导作用及半胱氨酸天冬氨酸特异蛋白酶casapase-3的激活.结果:外源性野生型PTEN基因经腺病毒介导成功转入RL95-2细胞,3种方法均检测出有PTEN mRNA及PTEN蛋白的表达,当感染复数(MOI)为50时,体外转染效率达到100%.Ad-PTEN显著抑制RL95-2细胞生长并诱导其凋亡.此外, Ad-PTEN还能诱导RL95-2细胞周期G0/G1期阻滞以及caspase-3的激活.结论:重组腺病毒Ad-PTEN是高效的基因转移系统,能将PTEN目的基因转移到丧失该基因功能的子宫内膜癌RL95-2细胞中,对RL95-2细胞产生强有力的生长抑制及凋亡诱导作用,其机制可能包括细胞周期G0/G1阻滞及caspase-3 蛋白酶的激活.     

PTEN重组腺病毒载体的构建及其在气道平滑肌细胞的表达

目的 应用pAdxsi载体系统构建携带PTEN基因的腺病毒载体.方法 将PTEN cDNA自载体pcDNA3-PTEN中切出,克隆至穿梭质粒pShuttle-GFP-CMV中,然后与腺病毒质粒pAdxsi在化学感受态细胞DH5α菌株内同源重组,经Pac-Ⅰ线性化后,重组子通过脂质体2000介导转染HEK293细胞,产生有感染能力的腺病毒,并测定其滴度,通过荧光显微镜能观察HEK293细胞内绿色荧光的表达;PCR检测腺病毒载体PTEN mRNA的表达,Western blotting检测PTEN蛋白在气道平滑肌细胞的表达.结果 感染腺病毒载体的HEK293细胞表达GFP随着时间逐渐增强,并且出现明显的细胞病变效应,经过3轮扩增后病毒达到合适的滴度,构建的Ad-PTEN腺病毒滴度为2×1010pfu/ml,PCR扩增后经琼脂糖凝胶电泳证实其表达,Western blotting检测纠腺病毒感染的气道平滑肌细胞内PTEN蛋白表达明显增高.结论 成功构建了携带野生型PTEN腺病毒载体,为进一步研究PTEN基因应用于哮喘治疗提供了实验基础.     

野生型PTEN 过表达对体外活化肝星状细胞内钙离子浓度的影响

目的 探讨野生型第10 号染色体缺失的磷酸酶张力蛋白同源物基因（PTEN）过表达对体外活化肝星状细胞（HSC）内钙离子浓度的影响。方法 体外培养活化大鼠肝星状细胞系（HSC-T6）,利用腺病毒载体,将野生型PTEN 基因转染活化HSC ;Western blot 及实时荧光定量聚合酶链反应（qrt-PCR）检测HSC 的PTEN 蛋白及mRNA 表达;采用钙离子荧光探针Rhod-2/AM,于激光扫描共聚焦显微镜下检测HSC 内钙离子浓度变化。实验分组：① Control 组：腺病毒转染时以DMEM 代替病毒液;② Ad-GFP 组：转染表达绿色荧光蛋白（GFP）的对照空病毒Ad-GFP ;③ Ad-PTEN 组：转染携带野生型PTEN 基因并表达GFP 的重组腺病毒Ad-PTEN。结果 野生型PTEN 在活化大鼠HSC 大量表达,3 组HSC 内钙离子浓度比较,差异有统计学意义（P <0.05）,Ad-PTEN 组HSC 内钙离子浓度（251.60±90.88）低于Control 组（1 953.95±132.99）及Ad-GFP 组（1 937.57±115.17）,而Control 组与Ad-GFP 组之间HSC 内钙离子浓度比较,差异无统计学意义（P >0.05）。结论 野生型PTEN 过表达可降低体外活化大鼠HSC 内钙离子浓度。     

肿瘤抑制基因PTEN对人气道平滑肌细胞迁移和增殖的影响

目的观察肿瘤抑制基因PTEN对人气道平滑肌细胞(HASMCs)迁移和增殖的影响机制。方法用重组PTEN腺病毒转染体外培养的HASMCs(Ad-PTEN组),并与携带绿色荧光蛋白(GFP)的腺病毒空载体(Ad-GFP组)和空白对照(MOCK)组对比,采用MTS测定细胞增殖、Transwell法观察细胞迁移、共聚焦显微镜观测细胞骨架的变化、免疫印迹法检测PTEN、p-Akt、Akt、p-FAK、FAK蛋白的表达。结果 Ad-PTEN组的吸光度(A)值和每单位面积迁移的细胞数显著低于Ad-GFP及MOCK组(均P<0.05),Ad-GFP和MOCK两对照组间差异无统计学意义(P>0.05),提示过表达PTEN基因能抑制HASMCs的增殖和迁移的作用。Ad-PTEN组细胞轮廓变细,伪足及应力纤维明显变少,而Ad-GFP、MOCK组细胞有少量短而细的应力纤维,很少丝状伪足形成。与AdGFP及MOCK组比较,Ad-PTEN组p-Akt表达水平和FAK蛋白的磷酸化水平显著下调(均P<0.05),Ad-GFP及MOCK两对照组间差异无统计学意义(P>0.05),说明过表达PTEN能下调Akt蛋白和FAK蛋白的磷酸化水平。结论过表达PTEN可能通过下调p-Akt及p-FAK的表达,抑制HASMCs的增殖和迁移,参与哮喘气道重塑的调控。     

重组腺病毒Ad-PTEN对肾癌786-O细胞增殖和凋亡的影响

目的:观察携带野生型PTEN基因的重组腺病毒Ad-PTEN介导786-O细胞中PTEN的表达,以探讨其对癌细胞增殖和迁移的抑制以及诱导细胞凋亡的作用。方法:将构建的重组腺病毒Ad-PTEN体外感染786-O细胞,荧光显微镜下观察感染效率;免疫印迹检测细胞中PTEN的表达;MTT实验观察其对细胞增殖的影响作用;细胞划痕实验观察其对细胞迁移的抑制;PI染色观察其对细胞凋亡的诱导作用。结果:以MOI为100的病毒量感染细胞后48 h,感染效率达到100%;感染病毒后,细胞可检测到PTEN蛋白的表达,细胞的增殖和迁移均受到抑制,细胞被诱导出现凋亡。结论:重组腺病毒Ad-PTEN可高效介导786-O细胞表达PTEN,并产生抑制细胞增殖和迁移以及诱导细胞凋亡作用,为肾癌的基因治疗提供理论基础。     

Ad-PTEN对人小细胞肺癌NCI-H446细胞生长的抑制作用

目的研究重组腺病毒第10号染色体同源丢失性磷酸酶张力蛋白基因（PTEN）对小细胞肺癌的抑癌增效和化疗增敏效应及其分子机制。方法采用重组腺病毒载体PTEN（简称Ad-PTEN）感染QBI-293A细胞,并用该细胞进行病毒扩增和效价测定。将Ad-PTEN感染NCI-H446小细胞肺癌细胞。分为5组：PBS组、空载体Ad组、Ad-PTEN组、顺铂（DDP）组和Ad-PTEN＋DDP组,Western blot鉴定PTEN基因表达,MTT法和流式细胞仪（FCM）检测Ad-PTEN对NCI-H446小细胞肺癌细胞的生长抑制和诱导凋亡的增效作用,用RT-PCR检测细胞凋亡相关基因p53、bax、caspase-3、bcl-2、和survivin的转录。结果 Ad-PTEN可在QBI-293A细胞中增殖。Ad-PTEN感染NCI-H446细胞后,Western blot检测到了PTEN基因的表达。Ad-PTEN组、DDP组、Ad-PTEN＋DDP组体外能明显抑制人NCI-H446小细胞肺癌细胞的生长和诱导凋亡,且Ad-PTEN＋DDP组效应较Ad-PTEN组、DDP组更为显著（均P〈0.05）。Ad-PTEN组、DDP组、Ad-PTEN＋DDP组的NCI-H446细胞中的p53、bax及caspase-3基因表达均上调,而Bcl-2和Survivin基因表达均下调,这些凋亡相关基因的上调或下调的表达趋势以Ad-PTEN＋DDP组最显著（均P〈0.05）。结论 Ad-PTEN体外可抑制NCI-H446小细胞肺癌细胞生长,Ad-PTEN对DDP的细胞毒作用具有增敏效应,其机制可能与上调p53、bax及caspase-3基因表达和下调bcl-2和survivin基因表达有关。     

pten基因重组腺病毒对卵巢癌细胞生长的抑制作用

目的:观察携带野生型pten基因的重组腺病毒(Ad-pten)体外转染高转移卵巢癌HO-8910PM细胞后的表达,并研究其对卵巢癌细胞抑制增殖、诱导凋亡和抑制迁移的作用.方法:利用Ad-Easy腺病毒载体系统构建Ad-pten,体外转染高转移卵巢癌HO-8910PM细胞,荧光显微镜检测Ad-pten的转染效率. Western印迹检测pten在HO-8910PM细胞中的表达;MTT实验观察pten对细胞生长的影响;HE染色法观察外源性pten基因表达对细胞形态学的影响;细胞划痕实验观察pten对细胞迁移的抑制作用;Hoechest33258凋亡染色检测pten基因对HO-8910PM细胞凋亡的诱导作用.结果:外源性野生型pten基因经腺病毒介导成功转入HO-8910PM细胞,Western印迹检测出有PTEN蛋白的表达,当感染复数MOI为100时,体外转染效率高达90%以上. pten显著抑制HO-8910PM细胞增殖、诱导其凋亡并能抑制其迁移.结论:重组腺病毒是高效的基因转移系统,能将pten目的基因高效地转移到高转移卵巢癌HO-8910PM细胞中,对细胞产生强有力的生长抑制及凋亡诱导作用,并能抑制其迁移.     

PTEN基因重组腺病毒载体对脑胶质瘤U251生长和凋亡的影响

目的探讨PTEN基因对人脑胶质瘤细胞株U251生长及凋亡的影响。方法携带PTEN基因的重组腺病毒载体转染U251细胞株,采用RT-PCR技术和Western blot方法检测Ad-PTEN-GFP组及Ad-GFP及Control组中PTEN mRNA及蛋白水平表达,用MTT及流式细胞仪检测各组细胞生长、周期及凋亡率等变化,Western blot检测细胞蛋白水平表达的变化。结果 Ad-PTEN-GFP转染U251细胞后,经荧光显微镜、PCR和Western blot证实转染成功。Ad-PTEN-GFP转染U251细胞后,细胞生长明显受抑制（P〈0.05）。Ad-PTEN-GFP转染组中p-Akt及P65蛋白水平下降,与Control组相比差异有统计学意义。结论 PTEN基因转染后能抑制人脑胶质瘤U251的生长,调控细胞周期,可能通过PTEN-Akt-NF-кB促进细胞凋亡。     

linc00346调控膀胱癌细胞增殖的分子机制

目的：探讨长链非编码RNA-linc00346 调控膀胱癌细胞增殖的分子机制。方法：通过实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）检测膀胱尿路上皮癌组织中linc00346 mRNA和PTEN mRNA的表达情况;沉默膀胱癌T24细胞系内linc00346的表达,通过RT-PCR检测T24细胞内的linc00346 mRNA和PTEN mRNA表达变化情况,通过蛋白质印迹（Western blot）法检测T24细胞内PTEN蛋白和PI3K/Akt信号通路中Akt、p-Akt蛋白的表达情况;CCK-8实验检测各组T24细胞的增殖能力。结果：与膀胱正常组织比较,膀胱尿路上皮癌组织中linc00346 mRNA表达上调,而PTEN mRNA的表达水平降低（均P ＜0.05）。沉默linc00346表达后,T24细胞内linc00346 mRNA的表达水平显著下降,PTEN mRNA的表达水平显著上调,PTEN蛋白水平升高,p-Akt蛋白水平降低（均P ＜0.05）;给予PTEN特异性抑制剂SF1670处理后,PTEN蛋白水平显著下调,p-Akt蛋白水平明显增加（均P ＜0.05）。沉默linc00346表达后,T24细胞的增殖能力明显受到抑制,给予SF1670处理后细胞的增殖能力显著增强（均P ＜0.05）。结论：linc00346可以增强膀胱尿路上皮癌细胞的增殖能力,其作用机制可能是通过抑制PTEN表达,激活PI3K/Akt信号通路实现的。     

PTEN基因真核表达载体重组质粒的构建及序列测定

目的 构建编码肿瘤抑制基因PTEN的正义与反义真核表达重组载体并进行其序列测定．方法 新鲜胎盘组织抽提基因组RNA；根据基因库PTEN基因序列分别设计合成三对反义引物及一对正义引物，采用RT-PCR法扩增编码PTEN的基因片段；将PTEN基因定向克隆到pcDNA3．1／Hygro(—)真核表达载体，筛选阳性重组子并鉴定；对重组子进行序列测定。结果RT-PCR所扩增的PTEN基因片段为241，239，227bp(反义)及1209bp(正义)，表明所克隆的基因为编码PTEN的基因片段。结论 成功构建编码肿瘤抑制基因PTEN的pcDNA3．1／Hygro(—)真核表达质较pcDNA3．1／Hygro(—)PTEN。     

恢复野生型PTEN基因表达对炎性乳腺癌MDA-MB-468体外生物学行为的影响

目的研究野生型PTEN基因转染对人炎性乳腺癌MDA—MB-468细胞体外生物学行为的影响及机制。方法应用基因重组技术构建重组质粒pcDNA3．1-PTEN，用脂质体转染乳腺癌细胞株MDA—MB-468，用RT—PCR、免疫组化及免疫印迹方法分析目的基因及其蛋白表达，并用免疫印迹方法检测转染后，在表皮生长因子的诱导下，磷酸化蛋白激酶B（PKB／Akt）的表达，四甲基唑蓝（MTT）法分析细胞增殖。Annexin V—FITC和PI双染流式细胞术检测细胞凋亡。结果RT—PCR、免疫组化及免疫印迹显示pcDNA3．1-PTEN转染组有PTEN mRNA及其蛋白表达，且显示转染组在表皮生长因子的诱导下，p-Akt蛋白表达下调。MTT检测表明pcDNA3．1-PTEN转染组活细胞数较其它各组均低（P〈0．01），流式细胞分析其凋亡率达21．68％。结论野生型PTEN基因依赖其磷酸酶活性可诱导乳腺癌MDA—MB-468细胞凋亡。     

表达PTEN同时沉默Livin基因载体的构建和鉴定

目的 构建表达PTEN基因、同时又沉默Livin基因的复合载体,探讨调控PTEN和Livin基因对胃癌细胞的影响.方法 根据GenBank中人DNA的PTEN基因(NM_000314)和Livin(NM_139317)基因的全长序列设计,分别构建出表达PTEN基因的真核表达载体pCL-neo-PTEN和沉默Livin基因的siRNA载体pRNAT-U6.1-Livin.切下pRNAT-U6.1-siLivin中的Livin siRNA单元,将其重组入pCL-neo-PTEN;鉴定得到表达PTEN同时沉默Livin基因的重组载体pCL-neo-PTEN-siLivin.脂质体包裹3个重组载体分别转染胃癌BGC823细胞,荧光定量RT-PCR和Western印迹检测胃癌BGC823细胞PTEN和Livin基因mRNA和蛋白表达情况.结果 经过限制性酶切和测序鉴定得到重组子pCL-neo-PTEN、pRNAT-U6.1-Livin和pCL-neo-PTEN-siLivin.转染pCL-neo-PTEN-siLivin的胃癌BGC823细胞中PTEN基因mRNA(0.897±0.112)和蛋白高水平表达,与对照组细胞(0.277±0.036)比较差异有统计学意义(P<0.05),与转染pCL-neo-PTEN的比较差异无统计学意义(P>0.05);转染pCL-neo-PTEN-siLivin的胃癌BGC823细胞中Livin基因mRNA(0.071±0.009)和蛋白表达抑制,与对照组细胞(0.338±0.044)差异有统计学意义(P<0.05),与转染pRNAT-U6.1-siLivin的差异无统计学意义(P>0.05).结论 成功构建出表达PTEN基因同时又沉默Livin基因的重组载体.     

环磷酰胺及其代谢产物作用于卵巢癌细胞SKOV3后对PTEN基因的影响

目的 探讨环磷酰胺(CP)及其代谢产物丙烯醛(ACR)作用卵巢癌细胞SKOV3后对人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(PTEN)的影响.方法 选择不同浓度CP及其代谢产物ACR作用重组PTEN蛋白,采用硝基苯磷酸二钠(PNPP)检测PTEN的磷酸化活性,Western blot技术检测蛋白表达,通过生物素与蛋白结合检测药物与蛋白的结合方式;同时分析PTEN基因通路P53/TP53的表达改变;不同药物浓度作用细胞后通过免疫沉淀(IP)方法得到目的蛋白,通过离效液相色谱(HPLC)检测其蛋白磷酸化活性.结果 药物代谢产物作用重组PTEN蛋白后其磷酸化活性随着药物浓度的增高而降低,ACR抗体作用表达随着药物浓度增高表达增多,不同实验组蛋白与生物素表达随药物浓度增高而增多,在细胞中随着药物浓度增高PTEN磷酸化活性降低,TP53蛋白表达随着药物浓度增加而减少.结论 CP代谢产物ACR可通过抑制PTEN蛋白磷酸化活性引起细胞毒性.     

The effects of antisense PTEN gene transfection on the growth and invasion of glioma cells

Objective:To study the effects of antisense PTEN gene on the growth and invasion of glioma cells. Methods: A pcDNA3. 1/Hygro(-) recombinant plasmid containing antisense PTEN gene fragment was constructed. Glioma cells of primary culture were transfected with antisense PTEN gene vector and stably transfected clones were selected. Then, the different growth and invasion abilities and the different MMP9 mRNA expressions of three kinds of cells were observed, including the transfected cells, untrans-fected cells and the cells transfected with empty vector. Results:The abilities of growth and invasion of the transfected cells and the expressions of MMP9 mRNA were obviously enhanced. Conclusion: Antisense PTEN gene could have a negative impact on the growth and invasion of primary culture glioma cells.     

PTEN基因重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的构建含PTEN基因的重组腺病毒载体,为PTEN进行肺腺癌的基因治疗奠定基础。方法用PTEN引物VT415和VT416扩增PTEN基因后,分别用EcoRⅠ＋SalⅠ双酶切PCR-PTEN和PSUCMV,回收并纯化PTEN cDNA小片断和PSUCMV的大片断,使两者连接获得含有PTEN基因的重组穿梭质粒载体PSUCMV-PTEN;采用细胞内同源重组方法构建PTEN基因重组腺病毒载体,将质粒PSUCMV-PTEN与含有5型腺病毒右臂的质粒Pbghe3通过Lipofectamine 2000共转染至293细胞,经PCR鉴定,扩增病毒,氯化铯密度梯度离心法纯化浓缩,测定病毒滴度。结果经双酶切和PCR进行鉴定,经鉴定正确的腺病毒命名为VSUCMV-PTEN,TCID_（50）法测定病毒滴度为1.0×10^10pfu/ml。结论成功构建了含PTEN基因的重组腺病毒载体Ad-PTEN,为下一步体内外实验证实PTEN对肺癌的抑制作用研究打下基础。     

Construction and Expression of Human PTEN Tumor Suppressor Gene Recombinant Adenovirus Vector

Phosphatase and tensin homologue deleted onchromosome10(PTEN)is a newtumor suppres-sor gene and possesses mutation in multiple kindsof tumors which include breast cancer[1].Teng[2]found the incidence for loss of heterozygosity(LOH)in breast cancer speci mens was48%(32/67),and the mutation and inactivation of PTENgene plays a central role in cell migration,growthandinvasion of breast cancer[3].This study ai ms atestablishing a kind of proliferative defective recom-binant adenovirus vector A…     

真核重组质粒pCDNA3.1-Flag-PTEN和原核重组质粒pGEX-6 P-1-GST-PTEN构建

目的构建人第10号染色体缺失的磷酸酶（PTEN）真核重组质粒pCDNA3.1-Flag-PTEN和原核重组质粒pGEX-6P-1-GST-PTEN,研究PTEN融合质粒生物学效应。方法根据基因库中PTEN序列,设计并合成相关引物。用基因重组技术将目的片段插入pCDNA3.1-Flag和pGEX-6P-1-GST空载质粒中,通过PCR和DNA测序,鉴定插入基因序列。将pCDNA3.1-Flag-PTEN转染到HEK 293细胞,将pGEX-6P-1-GST-PTEN转到E.coli BL-21中,通过Western blotting和考马斯亮蓝染色法分别检测PTEN蛋白的表达。结果PCR显示目的基因插入成功;DNA测序显示插入序列与目的基因序列完全一致,无位点突变;Western blotting和考马斯亮蓝染色法证实融合质粒可以在生物体内正确表达。结论成功构建PTEN相关真核和原核融合质粒并正确表达,为PTEN在帕金森疾病中的机制研究奠定了基础。     

PTEN体外转染对乳腺癌细胞ZR-75-1细胞周期和增殖的影响

目的探讨外源野生型PTEN基因对人乳腺癌细胞ZR-75-1细胞周期和增殖的影响,阐明PTEN基因抑制肿瘤细胞增殖的机制。方法利用脂质体介导法将重组质粒pBP-wt-PTEN导入人乳腺癌细胞ZR-75-1中,嘌呤霉素筛选稳定表达细胞株并扩增培养;采用细胞计数法检测肿瘤细胞增殖速度;流式细胞术检测细胞周期的变化。结果经嘌呤霉素筛选得到稳定表达细胞株;重组质粒pBP-wt-PTEN稳定转染可明显抑制ZR-75-1细胞的体外增殖,细胞周期明显改变,细胞从G1期到S期发生抑制,并在G1期峰前出现1个较为明显的凋亡峰。结论转染外源性野生型PTEN基因可使ZR-75-1细胞周期阻滞于G1期,并可抑制肿瘤细胞增殖。