壳聚糖作为组织工程软骨支架的实验研究

目的 探索壳聚糖作为组织工程技术中软骨细胞培养支架的可行性。方法 消化分离猪耳郭软骨细胞，接种于自制壳聚糖、壳聚糖-胶原复合多孔支架上培养，从光镜和扫描电镜观察其亲水性和对细胞吸附力，MTT检测软骨细胞在壳聚糖、壳聚糖-胶原上的黏附率及壳聚糖、壳聚糖-胶原复合多孔支架对细胞的增殖、功能的影响。结果 软骨细胞能够在壳聚糖、壳聚糖-胶原支架上黏附、伸展、增殖和发挥正常功能，MTT测得细胞黏附率分别为81.25%和87.50%，MTT测得软骨细胞在壳聚糖-胶原支架中的增殖能力较强。结论 壳聚糖、壳聚糖-胶原复合多孔支架与软骨细胞具有较好的相容性，壳聚糖-胶原复合多孔支架更适合作为软骨组织工程中的细胞培养支架。     

松质骨基质复合生物蛋白胶构建组织工程软骨的研究

目的尝试采用松质骨基质与生物蛋白胶复合材料构建组织工程软骨。方法体外培养大鼠软骨细胞,接种于松质骨基质／生物蛋白胶材料上行体外培养。采用HE、甲苯胺蓝染色免疫学检测、扫描电镜观察等方法观察所构建的组织工程软骨的特性。结果松质骨基质／生物蛋白胶组的组织学结构更接近于软骨样组织．其Ⅱ型胶原、蛋白多糖基因表达量及蛋白多糖含量明显高于松质骨基质组。结论松质骨基质／生物蛋白胶复合材料可用于构建组织工程软骨,是一种较理想的支架材料。     

胶原凝胶包埋软骨细胞接种CPPf/PLLA支架体外构建组织工程软骨

目的：探讨软骨细胞均匀、高效种植于三维支架的细胞接种方法。方法：将胶原凝胶包埋的软骨细胞整合入CPPf／PLLA三维支架并进行体外培养，细胞计数检测细胞粘附情况，倒置显微镜观察细胞在支架内分布的均一性，组织形态学检测细胞-胶原凝胶-支架复合物形成软骨组织的情况。结果：超过90％的种植细胞能有效、均匀种植于CPPf／PLLA支架，体外培养3周的复合物能形成较成熟的工程化软骨组织。结论：胶原凝胶包埋软骨细胞三维接种能有效提高组织工程软骨的体外构建质量，同时结合了两种材料的优势。     

组织工程软骨体外构建的相关实验研究

目的 探索组织工程软骨体外构建技术体系可行性.方法 种子细胞选用胎儿软骨细胞(口服药物流产胎儿,胎龄3～6个月).酶消化法获得第1代细胞,以50×106/ml浓度均匀接种于经聚乳酸(PLA)包埋聚乙醇酸(PGA)高分子聚合物支架,形成细胞-支架复合体,在体外静态培养.分别于2周、4周、8周进行大体观察、扫描电镜及组织学检测.结果 体外构建的组织工程软骨,随培养时间延长,色泽由2周时的乳白色逐渐呈现半透明,8周时接近正常软骨外观.扫描电镜显示软骨细胞与材料具有良好相容性,培养7天PGA纤维之间有基质沉积.HE染色示2周有大量软骨陷窝形成和均匀嗜碱性基质分泌,Safranin'O染色示基质有酸性蛋白多糖分布,Massons's trichome染色示基质有胶原成分,但含量较少,经免疫组织化学检测为特异Ⅱ型胶原.培养4周胶原成分开始明显增多,软骨陷窝形态接近成熟,8周细胞外基质蛋白多糖和Ⅱ型胶原含量丰富且分布均匀.结论 以成熟软骨细胞为种子细胞,运用组织工程技术在体外能构建出具有正常软骨组织结构特征的人组织工程软骨.     

骺板软骨细胞复合三维支架体外构建组织工程软骨的研究

目的探讨将骺板软骨细胞复合三维支架经体外培养,构建组织工程软骨的效果及其生物学特点. 方法将3周龄幼兔第1代骺板软骨细胞与液态的生物凝胶混合,接种于聚磷酸钙纤维/L-聚乳酸(CPPF/PLLA)三维支架材料,构建组织工程软骨组织块,连续培养4周.行大体、倒置显微镜及组织学、Ⅰ型和Ⅱ型胶原免疫组织化学光镜观察,定量检测硫酸糖胺多糖(GAG)含量. 结果构建的组织工程软骨块在培养过程中能保持其初始外形,种子细胞呈稳定的三维均相分布,外观逐渐呈乳白色、半透明,硬度亦不断增加.培养1周有软骨细胞陷窝形成,2周后形成富含Ⅱ型胶原和蛋白聚糖、具有典型软骨组织结构的工程化软骨,且Ⅰ型胶原逐渐转为阴性.4周时构建软骨的组织结构与天然骺板软骨相类似,硫酸GAG含量平均为天然骺板软骨的34%以上. 结论骺板软骨细胞复合三维支架体外培养可生成典型软骨,且可形成类似天然骺板软骨的组织结构,能满足修复骺板缺损的基本要求.体外培养1～2周可能是植入体内修复骺板缺损的较佳时机.     

胶原凝胶包埋软骨细胞接种CPPf/PLLA支架体外构建组织工程软骨

目的:探讨软骨细胞均匀、高效种植于三维支架的细胞接种方法.方法:将胶原凝胶包埋的软骨细胞整合入CPPf/PLLA三维支架并进行体外培养,细胞计数检测细胞粘附情况,倒置显微镜观察细胞在支架内分布的均一性,组织形态学检测细胞-胶原凝胶-支架复合物形成软骨组织的情况.结果:超过90%的种植细胞能有效、均匀种植于CPPf/PLLA支架,体外培养3周的复合物能形成较成熟的工程化软骨组织.结论:胶原凝胶包埋软骨细胞三维接种能有效提高组织工程软骨的体外构建质量,同时结合了两种材料的优势.     

组织工程软骨的体外实验研究

目的 :研究软骨细胞在纤维胶内体外生成组织工程化软骨的可行性。方法 :将 4 - 10× 10 7cells/mL细胞 /毫升的软骨细胞植入纤维胶 ,在体外培养 2个月后进行组织学、免疫组织化学分析。结果 :细胞在纤维胶内产生大量的软骨特异性Ⅱ型胶原和蛋白多糖。结论 :纤维胶内的软骨细胞可在体外培养的环境下生成大量透明软骨基质。     

软骨细胞与静电纺丝聚已内酯支架灌流培养构建组织工程软骨的实验研究

目的 采用静电纺丝聚已内酯(polycaprolactone,PCL)支架与软骨细胞复合培养,比较静态和灌流生物反应器培养条件下对细胞增殖及基质分泌的影响.方法 构建PCL支架,自制灌流生物反应器,分离兔软骨细胞,培养后接种于PCL支架,分为灌流培养组和静态培养组.在培养第3、7、14天对支架-细胞复合体行扫描电镜观察,DNA、糖胺聚糖和总胶原定量检测;在培养第14天分析软骨特异性基因表达并观察软骨基质分泌情况.结果 电镜观察PCL支架纤维直径(1.67±0.76) μm,孔径(17.65土7.11)μm,可见支架中软骨细胞黏附生长良好,灌流培养条件下细胞增殖快,且较好地保持了软骨细胞特征形态.在培养第7天,灌流培养组DNA定量高于静态培养组;在培养第3、7和14天,灌流培养组糖胺聚糖定量均高于静态培养组,灌流培养组糖胺聚糖/DNA比值均高于静态培养组.在培养第14天,灌流培养组Ⅱ型胶原、蛋白聚糖基因表达增加;软骨分化指数高于静态培养组.在培养第14天,组织学染色可见灌流培养促进细胞的增殖和渗透生长,提高了软骨基质的分泌,并见软骨陷窝样结构.结论 在灌流生物反应器培养条件下,静电纺丝PCL支架与软骨细胞复合培养可促进软骨细胞的增殖和基质的分泌,提高了组织工程软骨的质量.     

组织工程软骨构建的临床初步研究

目的:探讨利用组织工程技术在人体内构建软骨组织的可行性。方法:将体外培养扩增的第二代人肋软骨细胞,以细胞浓度50×106/ml与30%Pluronic-F127混匀,注入人耳后皮下或耳屏部位,3～6个月后在二期手术时部分取材,通过大体观察、组织学、电镜以及免疫组化等方法对新生软骨进行初步评价。结果:在3～6个月的随访中,观察到注射于耳后皮下的患者皮下有明显隆起,组织学检测显示有软骨陷窝和同源软骨细胞现象为成熟软骨组织,免疫组化染色有特异性的Ⅱ型胶原分泌。结论:采用体外培养的第二代人肋软骨细胞和Pluronic在人体内可构建组织工程软骨,证实了组织工程技术在人体内构建软骨组织的可行性。     

软骨细胞外基质/壳聚糖复合多孔支架和骨髓间充质干细胞构建组织工程软骨

[目的]探讨软骨细胞外基质和壳聚糖制备复合多孔支架,同时并对小鼠骨髓间充质干细胞构建组织工程软骨的可行性进行观察.[方法]以猪关节软骨细胞外基质和壳聚糖为原料,采用冷冻干燥法制备软骨细胞外基质/壳聚糖复合多孔支架.通过扣描电镜观察材料内部结构及孔径大小,液体位移法测定材料的孔隙率,MTT方法检测支架浸提液毒性.将小鼠的骨髓间充质干细胞(BMSCs)分离培养并用TGF-β1成软骨诱导后,与材料复合培养,扫描电镜观察细胞在材料上的生长粘附情况.[结果]软骨细胞外基质/壳聚精复合支架具有疏松多孔结构,孔径大小(159±36)μm,孔隙率为90.5%±2.3%,复合支架中的软骨细胞外基质成分甲苯胺蓝染色、番红O染色均呈阳性,MTT结果显示支架无细胞毒性.诱导的骨髓间充质干细胞在支架表面生长良好.[结论]软骨细胞外基质/壳聚糖复合材料具有合适的孔径和孔隙率,生物相容性良好,是组织工程软骨的良好支架载体.     

脱蛋白骨复合纤维蛋白胶构建骨组织工程支架的体外实验研究

[目的]探讨复合纤维蛋白胶的脱蛋白骨与单纯脱蛋白骨作为骨髓基质干细胞（MSCs）支架材料的差异，为骨组织工程提供合适的复合支架材料。[方法]实验组使用复合纤维蛋白胶的脱蛋白骨与MSCs复合培养，对照组用单纯脱蛋白骨与MSCs复合培养，取不同时间点进行光学显微镜观察、扫描电镜观察、细胞DNA含量检测及钙结节染色比较两组细胞的情况。[结果]实验组骨髓基质干细胞在黏附能力与分泌情况明显优于对照组，细胞DNA检测表明实验组细胞增殖明显优于对照组（P〈0．05）。[结论]复合纤维蛋白胶的脱蛋白骨比单纯脱蛋白骨更适合细胞生长，可作为MSCs的载体应用于骨组织工程的构建。     

力学因素在体外构建组织工程化软骨中的应用

力学因素是软骨组织工程中的重要影响因素之一。近年来的研究表明,力学作用可以刺激细胞外基质的分泌,改变三维支架上培养的软骨细胞的新陈代谢,从而促进软骨组织的生长与重建。本文就力学因素对软骨细胞增殖分泌的促进、力学刺激的传导机制及生物反应器在软骨组织工程中的应用等方面做一综述。     

组织工程软骨支架材料的研究进展

近年来,采用组织工程学方法构建软骨复合组织成为软骨修复方面新的研究领域。在组织工程中,种子细胞、可降解的支架材料以及细胞生长调节因子并称为组织工程的三大基本要素,其中支架材料在软骨修复过程中所起的作用至关重要。组织工程软骨支架材料的目的是为构建软骨细胞提供三维空间结构,有利于细胞的黏附、增殖,为细胞的生长提供良好的生长环境。     

降钙素在体内体外实验中对兔关节炎关节软骨退变及软骨下骨骨代谢的影响

[目的]研究降钙素(calcitonin, CT)对骨性关节炎关节软骨退变和软骨下骨骨代谢的影响.[方法]30只3个月龄雌性日本大耳白兔随机分为三组,其中两组行右膝关节前交叉韧带切断术(anterior cruciate ligament transaction,ACLT),分为ACLT+CT组和ACLT+NS组,第3组为Sham组.ACLT+CT给予每日1次皮下注射降钙素5 IU/(kg·d),持续8周,ACLT+NS组给予同样剂量生理盐水.术后8周后处死所有动物.取股骨髁制成切片行MMP-13和Ⅱ型胶原免疫组化染色.取胫骨近端制成硬组织切片行骨形态计量学检测.体外实验中,取兔膝关节软骨,经消化、培养,将第3代软骨细胞分三组:向IL-1β组加入人重组IL-1β(10 ng/ml). IL-1β+CT组加入人重组IL-1β (10 ng/ml)2 d后,再向培养液中加入CT(50 ng/ml).正常组不加任何诱导剂和干扰剂培养.然后行MMP-13、Ⅱ型胶原免疫组化检测和Realtime RT-PCR法检测.[结果]Sham组和ACLT+CT组软骨下骨骨小梁相对体积和厚度等均显著高于ACLT+NS组.Sham组和ACLT+CT组的Ⅱ型胶原的光密度值均显著高于ACLT+NS组,而MMP-13的光密度值显著低于ACLT+NS组(P<0.05).正常组和IL-1β+CT组的Ⅱ型胶原光密度值均显著高于IL-1β组而MMP-13的光密度值都显著低于IL-1β组(P<0.05).在正常组和IL-1β+CT组中Ⅱ型胶原的mRNA含量均显著高于IL-1β组而MMP-13的mRNA含量均显著低于IL-1β组(P<0.05).[结论]降钙素5 IU/(kg·d)皮下注射能够增加ACLT兔膝关节软骨Ⅱ型胶原的分泌和抑制MMP-13的表达,并可能通过调节软骨下骨的骨代谢和微结构来保护关节软骨; CT(50 ng/ml)能增加体外培养的含有IL-1β(10 ng/ml)的软骨细胞中Ⅱ型胶原的含量和抑制MMP-13分泌.     

Effects of heme oxygenase‐1 on bacterial antigen‐induced articular chondrocyte catabolism in vitro

This study tested the hypothesis that heme oxygenase‐1 (HO‐1) expression counteracts bacterial antigen‐induced catabolic metabolism in human articular chondrocytes. HO‐1 expression was induced in chondrocytes by the iron‐containing porphoryin, hemin. Anti‐catabolic and anti‐apoptotic effects of HO‐1 expression were evaluated following bacterial antigen (lipopolysaccharides, LPS) activation of chondrocytes by quantification of cytokine and cartilage matrix protein expression. Effects of HO‐1 over‐expression on chondrocyte matrix metabolism were evaluated using plasmid‐driven protein synthesis. Hemin increased HO‐1 expression and LPS increased interleukin‐1beta and interleukin‐6 gene and protein expression in chondrocytes. Hemin‐induced HO‐1 decreased LPS‐induced interleukin‐1beta and interleukin‐6 gene and protein expression. Increased HO‐1 expression partially reversed LPS‐suppression of aggrecan and type II collagen gene expression and suppressed LPS‐induced gene expression of IL‐6, inducible nitric oxide synthase (iNOS), matrix metalloproteinases (MMPs), and IL‐1beta. HO‐1 induction was inversely correlated with LPS‐induced chondrocyte apoptosis. HO‐1 over‐expression in chondrocytes decreased matrix protein gene expression. With LPS activation, increased HO‐1 expression decreased chondrocyte catabolism, partially reversed LPS‐dependent inhibition of cartilage matrix protein expression and protected against apoptosis. Without LPS, hemin‐induced HO‐1 and plasmid‐based over‐expression of HO‐1 inhibited cartilage matrix gene expression. The results suggest that elevated HO‐1 expression in chondrocytes is protective of cartilage in inflamed joints but may otherwise suppress matrix turn over. © 2013 Orthopaedic Research Society. Published by Wiley Periodicals, Inc. J Orthop Res 31:1943–1949, 2013     

3种可注射性支架体内构建组织工程软骨的比较研究

目的比较以纤维蛋白封闭剂(FS)、P luron ic-F 127(PF)、透明质酸(HA)3种可注射性支架体内构建组织工程软骨的效果。方法常规分离、消化、体外单层培养新生兔软骨细胞,分别将软骨细胞与3种支架材料混合接种于裸鼠皮下,并于第10周取材通过大体观察,湿重测定,GAG含量测定和组织化学检查来判断体内形成软骨的能力。结果三组均可形成软骨样组织块,其中FS组体积最大,质地较硬,表面光滑,软骨细胞位于成熟的陷窝中,阿尔新兰及Ⅱ型胶原免疫组化染色强阳性;PF组体积中等,质地柔韧,陷窝清楚,可以检测到阳性的阿尔新兰及Ⅱ型胶原表达。HA组只形成很小的组织块,硬度较差,含有的细胞数和分泌的基质最少,三组的GAG含量分别为(8.8±0.4)m g/g,(6.8±0.3)m g/g,(4.2±0.3)m g/g,各组间差异具有显著性(P<0.05,n=3)。结论3种可注射性支架中,FS成软骨作用最强,PF较好、HA组最差,FS和PF可以用于组织工程软骨的构建。     

肢体缺血再灌注后关节软骨的组织学观察

目的: 通过动物实验观察肢体缺血再灌注后关节软骨的病理变化, 证实缺血再灌注导致关节软骨的损伤, 并探讨关节缺血再灌注损伤与骨性关节炎形成的关系。方法: 健康中国本地兔42只, 随机分为正常对照组, 缺血4h组和缺血10h组, 分别于肢体缺血再灌注后0、1d和1、5、10周,取4只兔8条腿做标本, 行光镜观察, 及图像分析仪处理。结果: 早期(24h以内) 关节软骨的组织学改变在光镜下表现不明显。再灌注5周时损伤最为明显, 此后短期内(10周内) 软骨损伤不再加重。软骨组织形态学的定量观察,股骨外髁关节软骨全层厚度明显增加(P<0 .01), 非钙化层增加不明显, 而钙化层厚度则明显增加(P< 0. 01)。结论: (1) 证实了缺血再灌注导致关节软骨的损伤; (2) 关节缺血再灌注损伤也是导致骨性关节炎形成的重要原因。     

Study of the interactions between proximal femur 3d bone shape,cartilage health,and biomechanics in patients with hip Osteoarthritis

In this study quantitative MRI and gait analysis were used to investigate the relationships between proximal femur 3D bone shape, cartilage morphology, cartilage biochemical composition, and joint biomechanics in subject with hip Osteoarthritis (OA). Eighty subjects underwent unilateral hip MR‐imaging: T1ρ and T2 relaxation times were extracted through voxel based relaxometry and bone shape was assessed with 3D MRI‐based statistical shape modeling. In addition, 3D gait analysis was performed in seventy‐six of the studied subjects. Associations between shape, cartilage lesion presence, severity, and cartilage T1ρ and T2 were analyzed with linear regression and statistical parametric mapping. An ad hoc analysis was performed to investigate biomechanics and shape associations. Our results showed that subjects with a higher neck shaft angle in the coronal plane (higher mode 1, coxa valga), thicker femoral neck and a less spherical femoral head (higher mode 5, pistol grip) exhibited more severe acetabular and femoral cartilage abnormalities, showing different interactions with demographics factors. Subjects with coxa valga also demonstrated a prolongation of T1ρ and T2. Subjects with pistol grip deformity exhibited reduced hip internal rotation angles and subjects with coxa valga exhibited higher peak hip adduction moment and moment impulse. The results of this study establish a clear relationship between 3D proximal femur shape variations and markers of hip joint degeneration—morphological, compositional, well as insight on the possible interactions with demographics and biomechanics, suggesting that 3D MRI‐based bone shape maybe a promising biomarker of early hip joint degeneration. © 2017 Orthopaedic Research Society. Published by Wiley Periodicals, Inc. J Orthop Res 36:330–341, 2018.     

rhBMP-2体外诱导骨质疏松大鼠BMSCs成骨及VEGF表达的研究

目的:观察骨形态发生蛋白-2对骨质疏松时骨髓基质干细胞(BMSCs)体外成骨及成骨因子VEGF表达的影响,为骨质疏松证的防治提供新的方法。方法:将20只6月龄,体重(300±20) g雌性SD大鼠双侧卵巢切除,术后3个月利用双能X线骨密度仪测量大鼠全身骨密度并与术前比较,确保造模成功,并运用全骨髓贴壁法培养骨质疏松大鼠BMSCs,倒置相差显微镜下观察BMSCs形态。随机把骨质疏松大鼠BMSCs 第2代(p2)细胞分成实验组和对照组,分别加入完全培养基(含rhBMP-2)、成骨诱导液进行成骨诱导。2周后茜素红染色法检测各组细胞钙结节的形成,酶标仪测定碱性磷酸酶活性及RT-PCR法检测VEGF的表达量。结果:(1)大鼠全身骨密度:手术前后大鼠全身骨密度分别为(0.179±0.007),(0.158±0.006) g/cm²,差异有统计学意义(t=4.180,P<0.05).(2)茜素红染色:BMSCs(P2)成骨诱导2周后实验组染色效果明显强与对照组。(3)碱性磷酸酶活性:BMSCs(P2)成骨诱导2周后碱性磷酸酶活性实验组明显高于对照组,分别为(15.62±1.27),(8.62±0.93) μg/prot,差异有统计学意义(t=7.709,P<0.01).(4)BMSCs(P2)成骨诱导2周后VEGF表达:实验组明显高于对照组,分别为3.723±0.143,0.950±0.072,差异有统计学意义(t=29.462,P<0.01).结论:rhBMP-2能提高去卵巢骨质疏松大鼠BMSCs的体外成骨能力,可促进成骨因子VEGF的表达,调控VEGF的表达可能是骨形态发生蛋白-2参与骨代谢的机制之一。     

不同大小机械牵张力对MC3T3-E1成骨样细胞MMP-13/TIMP-1 mRNA表达的影响

目的:研究不同大小的机械牵张力对成骨细胞MMP-13/TIMP-1mRNA表达的影响。方法:通过自制的多通道细胞牵张应力加载系统对小鼠成骨样细胞MC3T3-E1同时施加6%、12%和18%的机械牵张力,作用24h后,用RT-PCR方法检测细胞受力后MMP-13/TIMP-1mRNA表达的变化。结果:细胞受力后,其MMP-13/TIMP-1mRNA表达随牵张力值的增大明显增加。结论:不同大小的机械牵张力可以影响成骨细胞的MMP-13/TIMP-1mRNA表达,进而影响骨改建。