犬骨髓基质细胞复合nHAC/CSH裸鼠皮下成骨的实验研究

目的：评价纳米晶羟基磷灰石/胶原/硫酸钙(nHAC/CSH)—犬骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)复合物体内异位成骨能力。方法：犬骨髓基质细胞(dBMSCs)通过密度梯度离心法分离得到,与nHAC/CSH复合,构建可注射骨,扫描电镜观察细胞生长情况,并将构建的可注射组织工程骨植入裸鼠体内,4周后行HE染色观察异位骨形成情况。结果：扫描电镜观察细胞生长良好,体内研究表明,可注射组织工程骨植入裸鼠皮下4周后有类骨样结构形成。结论：nHAC/CSH复合BMSCs具有良好的成骨活性。     

Bio-Oss胶原结合骨髓基质细胞构建组织工程骨的实验研究

目的:研究Bio-Oss胶原作为骨组织工程支架材料的可行性。方法:抽取成年小型猪骨髓,贴壁法获得骨髓基质细胞(BMSCs),经成骨诱导培养液体外培养、扩增、诱导后观察细胞增殖情况,并进行I型胶原、骨钙素的免疫细胞化学检测。将培养的第3代细胞接种于Bio-Oss胶原,进行超微结构观察,并将Bio-Oss胶原/BMSCs复合物植入裸鼠背部皮下,4、8周后进行组织学检测。结果:当接种密度为0.8×106/ml时,细胞与支架材料之间有最大附着量;VonKossa染色可见钙结节形成;I型胶原、骨钙素免疫细胞化学染色呈阳性;超微结构观察可见细胞生长附着于材料网孔内表面;组织学检测提示,8周时复合物内有新骨形成。结论:Bio-Oss胶原/BMSCs复合物显示成骨活性,Bio-Oss胶原可用作骨组织工程支架材料。     

可注射性组织工程骨的初步研究

目的探索可注射性组织工程骨的可行性.方法从兔髂骨骨髓细胞中获取骨髓基质成骨细胞,将骨髓基质成骨细胞与20g/L藻酸钠溶液混合形成骨髓基质成骨细胞/藻酸钠复合物,使细胞的终浓度为5×106/ml.将骨髓基质成骨细胞/藻酸钠复合物注射于裸鼠背部皮下,用氯化钙固化为凝胶体.结果注射后4、8周注射物在裸鼠背部皮下形成硬结节,X线片均显示有明显成骨现象.组织学分析显示标本有大量新骨形成,并具有骨髓腔样结构.结论应用藻酸钠复合骨髓基质成骨细胞可以通过注射方式在动物体内形成骨组织.     

可注射性骨的实验研究

目的　采用温度固化型聚氧化乙烯水凝胶作为骨髓基质干细胞 (MSCs)的注射型载体 ,观察水凝胶-细胞复合物注入裸鼠体内后骨组织的形成情况。方法　体外培养并扩增兔MSCs,将细胞按 5× 10 7/ml接种于聚氧化乙烯溶液中 ,形成凝胶后注射于裸鼠背部皮下组织中 ,于注射后 1,2个月取材 ,通过大体标本观察、组织学检查 ,观察骨组织的形成情况。结果　注射后 1个月 ,在皮下形成稍硬的结节 ,2个月时形成的结节质地坚硬 ,外观为骨组织 ;1个月标本中可见大量的软骨组织和类骨组织 ,2个月标本中有成熟的骨组织形成。结论　温度固化型聚氧化乙烯水凝胶作为成骨细胞载体 ,可以通过注射的方法再造骨组织 ,具有广阔的应用前景。     

多孔型活性CPC复合骨髓基质细胞构建组织工程骨的实验研究

目的:观察多孔型活性磷酸钙骨水泥用作骨组织工程支架材料的可行性.材料与方法:抽取成年毕格犬的骨髓,贴壁法获得骨髓基质细胞,经成骨诱导培养液体外培养、扩增、诱导后观察细胞增殖情况.将培养的第3代细胞接种于多孔型活性磷酸钙骨水泥,进行超微结构观察,并将多孔型活性磷酸钙骨水泥/骨髓基质细胞复合物植入毕格犬背部皮下,2,4周后进行组织学检测.结果:碱性磷酸酶染色呈阳性;Von Kossa染色可见钙结节形成;骨钙素免疫细胞化学染色呈阳性;超微结构观察可见细胞生长附着于材料网孔内表面;组织学检测提示4周时复合物内有新骨形成.讨论:活性多孔CPC/BMSCs骨修复材料孔径250μm,孔隙率为70%,易于BMSCs的渗入发育成骨.结论:多孔型活性磷酸钙骨水泥/骨髓基质细胞复合物显示良好的成骨活性,多孔型活性磷酸钙骨水泥可以用于骨组织工程支架材料.     

犬骨髓基质细胞和β-磷酸三钙复合物在裸鼠体内的成骨性能

目的：观察犬骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）和支架材料β-磷酸三钙（β-TCP）复合物植入裸鼠体内的成骨情况。方法：首先在体外构建BMSCs和β-TCP的复合物，大小3mm^3左右。实验分为3组：裸鼠体内植入单纯β-TCP，植入未经体外培养的BMSCs和β-TCP复合体，植入体外培养5d的BMSCs和β-TCP复合体。植入后1周、1个月和3个月取出标本，进行大体观察、X线片观察、灰度测定、组织学观察及成骨图像分析。结果：植入后3个月，BMSCs＋B-TCP体外培养组X线片密度最高，DigiDens X线片灰度值3组分别为：0．605〉0．555〉0．473（P〈0．01）。HE染色显示：1个月后，BMSCs＋β-TCP体外培养组见新骨和血管形成；3个月后，BMSCs＋β-TCP体外培养组新骨形成明显，并有大量血管生成．BMSCs＋β-TCP体外未培养组少量成骨，单纯β-TCP组未见明显成骨。成骨罔像分析3组成骨密度均数分别为：23．99％、8．36％、1．23％（P〈0．05）。结论：BMSCs＋β-TCP复合物植入裸鼠体内4周出现新骨形成．3个月时．骨形成明显并有血管化生成。     

Beagle犬骨髓基质细胞复合A-PCPC裸鼠皮下成骨的实验研究

目的:观察支架材料活性磷酸钙骨水泥(active porous calcium phosphate cement,A-PCPC)及其与Beagle犬骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)复合体在裸鼠体内的成骨性能.方法:抽取Beagle犬骨髓,体外分离培养、成骨诱导、扩增BMSCs并通过细胞化学方法检测其成骨表型.体外构建BMSCs/A-PCPC复合体,并行扫描电镜超微结构观察.将复合体植于裸鼠背部皮下,同期植入单纯A-PCPC作为对照组.术后2、4、8周取材,HE染色,进行组织学及组织形态计量学分析.结果:ALP染色阳性,Von Kossa染色可见钙结节形成.扫描电镜可见细胞贴附于材料表面及孔隙表面生长.HE染色显示,2周时,复合体组可见少量编织骨,单纯材料组成骨较少.4周时,复合体组可见编织骨向小梁骨转化,单纯材料组可见大量骨样组织.8周时,复合体组新骨趋于成熟,单纯材料组骨成熟度较差.结论:A-PCPC支架接种BMSCs后显示良好的成骨活性,能够促进未成熟骨矿化.可以作为骨组织工程支架材料.     

釉基质蛋白联合骨髓基质细胞膜片促进类牙骨质异位生成的实验研究

目的:研究釉基质蛋白(enamel matrix proteins,EMPs)诱导犬骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)在裸鼠体内促进类牙骨质异位生成的作用和意义。方法:体外分离培养犬骨髓基质细胞并制备细胞膜片,包裹于牙本质根片上,与煅烧骨块紧密贴合捆绑后,制成牙根片/细胞膜片/煅烧骨复合物,体外模拟根周系统。据牙根片是否事先涂覆釉基质蛋白(EMPs),分为实验组和对照组。将2组的"牙根片/细胞膜片/煅烧骨复合物"分别植入裸鼠背部皮下,8周后取材,进行组织学观察和免疫组化检测。结果:实验组的根片上新生出了不规则类牙骨质样物质,并有矿化基质沉淀,有较强骨桥素(osteopontin,OPN)表达;对照组根片上未见类牙骨质样物质或矿化基质沉淀,OPN表达较弱。结论:釉基质蛋白在体内能诱导骨髓基质细胞向类成牙骨质细胞方向分化,从而促进牙周再生。     

松质骨基质-骨髓基质成骨细胞复合物的异位成骨作用

目的：观察松质骨基质－ 骨髓基质成骨细胞复合移植皮下成骨作用,以探索松质骨基质作为骨组织工程支架材料的可行性。方法：新生兔骨髓细胞体外培养、诱导后,接种于藻酸盐／松质骨基质中,形成松质骨基质／藻酸盐／骨髓基质成骨细胞复合物,并植入裸鼠背部皮下,对照组单纯植入松质骨基质。植入４、８ 周后行 Ｘ线摄片和组织学检查,观察骨形成情况。结果：松质骨基质／骨髓基质成骨细胞复合物皮下成骨效果明显优于松质骨基质。前者兼有纤维成骨和软骨成骨,以纤维成骨为主;后者仅见少量软骨成骨。结论：松质骨基质可以作为一种良好的骨组织工程支架材料。     

新型多孔磷酸钙复合骨髓基质干细胞组织工程实验研究

目的观察新型生物材料多孔磷酸钙的生物相容性及复合骨髓基质干细胞（BMSCs）异位成骨情况。方法体外培养第2代Beagle犬BMSCs,转染绿色荧光蛋白（GFP）后与多孔磷酸钙（CPC）复合培养,获得最佳复合浓度,倒置和荧光显微镜、扫描电镜下观察BMSCs黏附和生长情况,复合体植入裸鼠皮下8周观察异位成骨。结果BMSCs转染GFP与多孔CPC复合培养1 d,细胞从材料中爬出,形态正常,7 d可见细胞伸出伪足,分泌基质;复合体可异位成骨。结论多孔CPC生物相容性好,是一种较理想的骨组织工程支架材料。     

可注射壳聚糖温敏水凝胶对犬骨髓基质细胞生物学行为的影响

目的:探讨可注射壳聚糖(chitosan,CS)基温敏水凝胶对犬骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)生物学活性的影响。方法:利用密度梯度离心法获得犬BMSCs,含10%胎牛血清的L-DMEM培养液进行原代培养并进行初步鉴定。合成壳聚糖温敏水凝胶,光镜下观察BMSCs在凝胶中的存活情况。制备凝胶浸提液,检测其对细胞增殖分化的影响。采用SPSS13.0软件包对实验数据进行单因素方差分析。结果:犬BMSCs可在壳聚糖温敏凝胶中存活。壳聚糖浸提液组对BMSCs的增殖与正常培养液组相比,无显著性差异;但在培养第1、4、7天时,矿化培养液组和矿化浸提液组的细胞增殖率明显低于未矿化的完全培养液组和壳聚糖浸提液组,第10天时,4组间无显著性差异。壳聚糖矿化浸提液组碱性磷酸酶和骨钙素活性明显提高。结论:制备的壳聚糖温敏水凝胶具有良好的生物相容性,可进行水凝胶复合BMSCs的体内外实验研究。     

犬骨髓基质细胞片层在构建组织工程骨中的作用

目的:探讨犬骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs)细胞片层在构建组织工程骨中的价值.方法:制备犬同种异体脱钙骨基质(dermineralized bone matrix,DBM).将人重组骨形态发生蛋白-2(rhBMP-2)复合到DBM上.抽取犬髂骨骨髓,采用密度梯度离心法分离犬骨髓基质细胞(BMSCs).将经成骨诱导的第3代细胞接种于温度反应性培养皿中,制备BMSCs细胞片层.用得到的BMSCs细胞片层包裹DBM/rhBMP-2/BMSCs复合体,植入犬背阔肌血运丰富的肌筋膜下为实验侧,以无BMSCs细胞片层包裹的DBM/rhBMP-加MSCs复合体为对照侧.术后4、8、12周取材,行组织学观察,评价体内异位成骨的情况.采用SPSS13.0软件,对数据进行两样本均数差别的t检验.结果:实验侧成骨面积大于对照侧,2组差异有显著性(P<0.05).术后12周,实验侧生成大量板层骨,有哈弗系统形成,骨髓腔内有红骨髓.对照侧有板层骨形成,无哈弗系统形成,骨髓腔内无红骨髓.结论:BMSCs细胞片层可促进具有致密板层骨和哈弗系统的组织工程骨的形成.     

应用兔骨髓基质细胞膜片与珊瑚支架构建组织工程骨

目的：探讨应用富血小板血浆与骨髓基质细胞（BMSCs）构建骨髓基质细胞膜片，以及应用骨髓基质细胞膜片与珊瑚支架构建组织工程骨的可行性。方法：将取自同一供体兔的BMSCs与富血小板血浆复合后，共同在体外培养10天，构建出BMSCs膜片，用其包裹珊瑚支架后植入裸鼠背部皮下，另以单纯BMSCs种植到珊瑚支架及以单一珊瑚植入作为对照。术后4周和8周取材，通过组织学观察和组织形态测量分析，评价其成骨情况。采用SPSS11．0软件，对所得数据进行统计学分析。结果：BMSCs与富血小板血浆共同在体外培养10d，可构建出厚约2mm的BMSCs膜片。用其包裹珊瑚支架后植入裸鼠背部皮下4周和8周，在珊瑚表面及其孔洞内有大量软骨和骨质形成．其成骨量明显大于单纯BMSCs种植组。单一珊瑚植入组未见骨或软骨形成。结论：将富血小板血浆与BMSCs复合后共同在体外培养，可构建出具有一定厚度的BMSCs膜片，将此膜片包裹珊瑚支架所形成的膜片一支架复合体具有良好的成骨活性.     

犬自体血清培养骨髓基质细胞的实验研究

目的:探讨犬自体血清培养骨髓基质细胞的可行性方法:获取犬自体血清,配制成含10%和20%自体血清的培养液,与含10%胎牛血清的培养液在相同条件下培养犬骨髓基质细胞(BMSCs)。通过倒置显微镜下观察细胞形态,细胞计数以及MTT法对细胞增殖情况进行检测。并且对第2代细胞用3种不同血清成分培养液(均加入β-甘油磷酸钠、抗坏血酸及地塞米松)进行成骨诱导分化,采用免疫组化检测碱性磷酸酶及钙结节形成。对检测到的量化数据做统计学分析,比较各组间的差异,以评价不同血清成分培养液对细胞增殖分化的影响。结果:3组细胞的生长及形态无明显差别,经过诱导培养均能形成钙结节。对3组间量化检测做统计学分析,各组间差异无统计学意义。结论:制备的犬自体血清能完全替代胎牛血清对骨髓基质细胞进行诱导培养。     

BMP受体在大鼠骨髓间充质细胞成骨中的作用

目的:研究骨形成蛋白受体(BMP-R)在大鼠骨髓间充质细胞(BMSCs)成骨中的作用机制。方法:分离大鼠BMSCs,将原代细胞分为4组,分别应用普通培养基(CM)、成骨诱导培养基(OM)、骨形成蛋白-2(BMP-2)和OM+BMP-2诱导培养基培养。应用碱性磷酸酶(ALPase)活性和钙结节染色(Von Kossa法)检测成骨分化程度,RT-PCR检测骨形成蛋白受体(BMP-R)的表达情况。采用SPSS16.0软件包对数据进行单因素方差分析。结果:OM可诱导BMSCs成骨分化,表现出高碱性磷酸酶活性和基质矿化能力。BMP-2可提高OM诱导BMSCs成骨分化的能力;OM在早期即可诱导BMP-RⅠA和BMP-RⅡ的表达,而BMP-2诱导BMP-R较迟。结论:BMP-2可提高OM诱导BM-SCs分化成骨的能力,BMP-R在BMSCs分化成骨中起重要作用。     

骨髓基质干细胞片层的制备及其在组织工程骨中应用的初步研究

目的：探讨骨髓基质干细胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）片层（cell sheet）的制备方法,并观察其在实验犬体内构建组织工程骨时的成骨作用。方法：密度梯度离心法获取实验犬骨髓基质干细胞,经成骨诱导培养后,利用温度感应性培养皿（temperature-responsive culture dish）制备细胞片层后在体外包裹犬同种异体脱钙骨基质（demineralized bone matrix,DBM）,相差显微镜和扫描电镜观察细胞及片层形态;将复合体植入实验犬背阔肌筋膜下,组织学方法观察术后组织工程骨的骨形成情况。结果：细胞片层成功制备,并与支架材料复合良好,术后16周组织学显示形成类似板层骨的致密骨组织。结论：利用温度反应性培养皿可成功制备BMSC细胞片层,细胞片层包裹支架材料后在实验动物体内可形成具有类似板层骨结构的组织工程骨。     

犬牙周膜细胞和骨髓基质细胞相互作用的体外实验研究

目的:研究牙周膜细胞(PDLCs)和骨髓基质细胞(BMSCs)共培养是否更利于牙周组织再生。方法 :用组织块法培养PDLCs,用全血贴壁法培养BMSCs,检测它们的成骨、成脂诱导分化能力。用Transwell小室共培养这两种细胞,通过3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)和实时荧光定量PCR(Real-time PCR)检测共培养后这两种细胞的增殖能力及部分基因的表达变化。结果:PDLCs和BMSCs具有多向分化潜能。共培养能促进它们各自增殖,上调Ⅰ型胶原(COLI)、碱性磷酸酶(ALP)、骨涎蛋白(BSP)、骨钙素(OCN)、核心结合因子2(RUNX2)的表达。结论:PDLCs和BMSCs共同运用作为种子细胞可能更有利于牙周组织再生。     

降钙素基因相关肽在成骨过程中表达的动物实验研究

目的:观察降钙素基因相关肽(calcitonin gene-related peptide,CGRP)在犬骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)向成骨细胞分化过程中,及应用BMSCs构建组织工程骨提升犬上颌窦底后骨组织中的表达情况。方法:体外分离培养犬BMSCs,通过成骨诱导采用实时荧光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction,Q-PCR)和免疫荧光技术检测CGRP在不同时间点的表达情况。犬上颌窦底提升术后,分别在两侧上颌窦底植入BMSCs+Bio-Oss骨粉(实验组)和Bio-Oss骨粉(对照组)。12周后处死并获取动物标本,对窦底区骨组织行CGRP免疫组化染色。结果:体外实验示CGRP表达量随成骨诱导分化呈时间依赖性递增(P<0.05);上颌窦底提升实验组CGRP表达量明显高于对照组(P<0.05),且CGRP主要分布在骨再生代谢活跃区域。结论:CGRP表达量与骨再生过程密切相关,可考虑作为骨代谢活跃度的标志。     

应用富血小板血浆和骨髓基质细胞构建细胞-膜片及其异位成骨的实验研究

目的：探讨应用富血小板血浆（platelet rich plasma,PRP）和骨髓基质细胞（marrow stromal cells,MSCs）构建细胞-膜片的方法并评价膜片包裹珊瑚支架后的异位成骨能力。方法：将体外培养扩增的兔MSCs悬液与PRP混合,滴加到6孔培养板上,再滴加牛凝血酶溶液,形成凝胶样MSCs／PRP混合物,置于孵箱内培养。第1周用DMEM完全培养液,后2周改用DMEM诱导培养液。用得到的细胞-膜片包裹珊瑚圆片后,植入裸鼠背部皮下,以单纯珊瑚植入作对照。术后4周和8周取材,通过组织学观察,评价其异位成骨情况。结果：细胞-膜片具有一定的韧性和可操作性。扫描电镜观察显示：膜片由大量的纺锤样成骨细胞有规律地密集在一起而形成。组织学观察显示：术后4周和8周,膜-支架复合体珊瑚支架的表面及其孔洞内有大量的软骨或骨形成,以软骨内成骨的方式成骨;单纯珊瑚植入组,珊瑚表面及其孔洞内有大量纤维结缔组织长入,未见软骨或骨形成。结论：用PRP和MSCs构建细胞-膜片的方法简便,膜片包裹珊瑚支架形成的膜一支架复合体具有良好异位成骨能力。     

HMGB1对大鼠骨髓基质干细胞增殖和分化的影响

目的：探讨高迁移率族蛋白B1（HMGBl）对于大鼠骨髓基质干细胞BMSCs增殖、成骨／破骨的影响。方法：原代培养的大鼠BMSCs,分别以浓度为0,100,500ng／mLHMGBl作用于BMSCs,M‘rr法检测细胞数目;以浓度为0,100,500ng／mLHMGBl作用于BMSCs,7d后行AIJP染色和RT—PCR检测成骨／破骨基因的表达（骨钙素OCN,骨保护素OPG,核因子KB受体活化因子配体RANKL）。结果：HMGBl存100、500ng／mL浓度时,第3d和第5dBMSCs的OD值有明显升高,在第7d对BMSCs的ALP染色没有明显的改变,OCN和OPG基因的表达也没有明显变化,HMGBl明显提高了BMSCs的RANKI．及RANKI．／OPG基因表达。结论：HMGBl对大鼠BMSCs的增殖和破骨基因表达有明显的促进作用,为HMGBl应用于临床提供实验依据。